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1、NMR方法解析蛋白质结构,冯银刚 北京核磁共振中心 () 北京大学化学与分子工程学院 ,2006.4.12,蛋白质结构层次,氨基酸通过肽键形成的生物高分子 一级结构、二级结构、三级结构、四级结构,肽键具有双键性质而不能任意旋转 主链可旋转的二面角，,20种常见的氨基酸残基 通常NMR中一个自旋系统是指一个氨基酸残基上的所有原子,核磁共振方法解析蛋白质溶液结构,测定原子（氢原子）之间的距离信息和其他约束信息，得到空间结构模型 化学结构（氨基酸序列，即一级结构）已知，测定空间结构（三级结构，四级结构）,适用范围分子量,分子量受限：谱峰重叠，分子增大造成横向弛豫时间减少（线宽增加） 同核二维1H谱：

2、80氨基酸 异核多维（二维、三维）： 常规三共振（1H,15N,13C） 200氨基酸 氘标记，特殊标记 已报道有700氨基酸 同核样品可以是天然提取、化学合成或分子生物学方法培养制备 标记样品通常只能通过分子生物学方法培养制备,常规样品,浓度：毫摩尔每升 500uL 10kDa 5毫克每样品 均一 没有聚合 水溶液（10%重水锁场） pH7.5 常用缓冲体系：Tris-HCl, 磷酸盐，醋酸盐 稳定性：室温下大于一周 NaN3 蛋白酶抑制剂,蛋白质的一维谱,同核方法,指认方法不同：2D 1H-1H 两种样品：H2O, D2O 实验 TOCSY, COSY, NOESY 自旋系统指认，序列指认

3、 指纹区：HN-HA每个残基一个峰,同核方法指认,基于相邻序列间的NOE,三共振方法以杨树谷氧还蛋白C1为例,实验之前蛋白质基本性质,杨树谷氧还蛋白C1 (Grx-C1) 分子量：117个氨基酸残基，12.5kDa 等电点：8.49 同源性：35% 功能：谷胱甘肽依赖的氧化还原酶 稳定、无聚合,MASKQELDAALKKAKELASSAPVVVFSKTYCGYCNRVKQLLTQVGASYKVVELDELSDGSQLQSALAHWTGRGTVPNVFIGGKQIGGCDTVVEKHQRNELLPLLQDAAATAKNPAQL,样品制备分子生物学方法,基因克隆：cDNA质粒载体 蛋白质表达纯化

4、大肠杆菌E. coli BL21(DE3) 离子交换色谱，凝胶过滤 纯度：SDS-PAGE 电泳上为单一条带 同位素标记 使用M9培养基：无机盐，葡萄糖 15N NH4Cl, 13C 葡萄糖 样品 1mM 蛋白质 磷酸钾缓冲液，pH6.4 ， 90%H2O/10%D2O 0.01% DSS （化学位移校准） 40mM DTT，0.01% NaN3，蛋白酶抑制剂,数据采集,谱仪 Bruker 500MHz, 600MHz 三共振探头 采集用于解析一个蛋白质所需要的全部谱图时间约12月,数据处理,处理的内容： 线性预测加窗函数充零傅立叶变换相位校正基线校正 在线与离线处理 二维谱：每个约几兆 三维

5、谱：每个几十兆到几百兆 nmrPipe 多维谱的处理：每一维都要分别进行傅立叶变换,化学位移校准,重要性 1H使用 DSS (2,2-dimethylsilapentane-5-sulfonic acid sodium salt) 异核：间接校准 以DSS的0 ppm处的频率乘以换算因子得到异核的0 ppm的频率,NMR初步鉴定,蛋白质折叠程度,H2O,DSS,DTT,NMR初步鉴定,1H-15N HSQC 分散程度：折叠程度 确定谱宽 指认基础：每个氨基酸（除脯氨酸外）都在HSQC上有一个峰,三维实验（双共振、三共振）,减少谱峰堆积 利用异核之间较大的耦合常数 基于J耦合进行共振指认，减少对

6、空间构象的依赖,三维实验,绝大多数异核多维实验可以类比于二维COSY, TOCSY, NOESY及其组合 主链指认实验 侧链指认实验 NOE实验,1 2 3 HN-NH-Ca(i,i-1),HN,Ca,NH,化学位移指认,化学位移：每个原子的身份证 主链指认 序列连接 氨基酸类型判断,主链指认,HNCACB-CBCA(CO)NH,化学位移指认,侧链指认 3D TOCSY或 COSY H(C)CH-TOCSY 芳环 (HB)CB(CGCD)HD (HB)CB(CGCDCE)HE 通过NOE确认指认 主链 侧链,用于Grx-C1指认的实验,主链指认：2D 1H-15N HSQC, 3D HNCA,

7、 HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO 10天 侧链指认：2D 1H-13C HSQC, 3D HBHA(CBCA)(CO)NH, (H)C(CO)NH, H(C)(CO)NH, 1H-15N TOCSY-HSQC HCCH-TOCSY, CCH-TOCSY, HCCH-COSY, CCH-COSY, 2D (HB)CB(CGCD)HD, (HB)CB(CGCDCE)HE 20天 NOE：3D 15N NOESY-HSQC, 13C NOESY-HSQC(for aliphatic region), 13C NOESY-HSQC(for aromatic reg

8、ion) 10天,Grx-C1指认结果,1H,15N,13C指认率：98% 1H-15N HSQC 上所有谱峰得到了指认 J. Biomol. NMR 2005, 31:263-264 BMRB 6410 ,由化学位移得到二级结构的信息,二级结构 CSI：化学位移与无规卷曲的多肽化学位移之差 TALOS：基于数据库比对预测二面角 可用于结构计算和分析,结构计算,基本方法 由实验得到各种构象约束信息：距离，二面角 约束信息是不完备的 约束信息是不精确的 计算满足这些约束条件的构象 距离几何(Distance Geometry) 约束条件下的分子动力学

9、模拟(Restrained Molecular Dynamics Simulation),约束信息,距离约束 1H-1H NOE 氢键 二面角约束 主链 侧链 肽键：反式顺式 其他 手性 L-氨基酸,约束生成,NOE 指认 Unique：只有一种可能 Ambiguous：有多种可能 转化为距离 实验通常可检测 5 距离是不精确的：距离范围 距离是大量的精确结构,其中一种可能是正确的 多种可能都是正确的（谱峰重叠）,二面角约束,a-helix: f = -100 to -20, y = -70 to -10 b-sheet: f = -180 to -60, y = 20 to 180,二面角

10、预测：CSI或TALOS 实验：HNHA,HNHB等 , 对特定的二级结构有一定的分布 拉氏图(Ramachandran plot) 最佳区 次佳区 一般区 不允许区,二面角约束,二级结构判断：特征的NOE信号,氢键约束,-Helix,Parallel -Strands,Anti-parallel -Strands,H-O 2.0 N-O 3.0,N-H - - - - O,根据二级结构或实验判断氢键,分子动力学模拟（结构计算）,模拟分子随机运动，使其达到能量的最小值 约束条件转化为MD中的能量项 Vtotal= Vbond+ Vangle+ Vdihedr+ Vvdw+ Vcoulomb+

11、VNMR 模拟退火：克服局部的能量最小点 计算多个结构，取能量较低的若干结构作为结果Ensemble (NMR信息的不完备和不精确),结构计算,结构检查 违约分析：查错 化学位移指认 NOE指认 其他效应对NOE的影响 结构评价 反复计算若干循环,违约：结构计算是计算能量最低的结果，因此最后的结构可能不完全符合每一个约束。违约产生原因是约束中存在错误，造成约束之间或约束和化学结构之间存在矛盾。,结构评价,能量 二级结构 拉氏图 尽可能少的氨基酸残基处于不允许区 RMSD（均方根偏差） 表明结构的收敛程度,自动化结构计算,NOE自动指认 CANDID/CYANA 只需提供指认的化学位移列表和NO

12、E谱峰列表 自动进行NOE指认 自动通过7个结构计算循环（100个结构取二十个），逐步优化指认结果 自动计算结果正确性依赖于原子化学位移指认的比例和正确性 （至少90%） SANE 依赖初始结构的自动NOE指认,Grx-C1的结构计算,CYANA 结构初步优化 力场相对简单 运行速度快 无需初始结构 结构相对较为粗略 Amber 结构精修 具有更精细的力场参数，使用溶剂化模型（或显式加溶剂）从而获得更加合理的局部构象 需要整体折叠正确的初始结构 运算量大，速度慢,Grx-C1的结构计算,CANDID/CYANA得到初始结构（全自动） 2 CPU, 8小时 SANE-CYANA循环，进行初步优化

13、（半自动） 手工分析违约和未指认的NOE 每个循环 2CPU 1小时 20-40个循环 SANE-AMBER循环，进行结构精修（半自动） 每个循环 20 CPU 15小时 1030个循环,结构计算结果,PDB 1Z7P(ensemble), 1Z7R(mean) /pdb,结构计算结果,约束统计 NOE： 4845 二面角：160 氢键：47 手性：287 违约状况 距离 无0.2 二面角 无,结构计算结果,结构评价,三共振方法所需时间,提取样品24周 数据采集48周 数据处理14小时每实验 共振指认24周 结构计算24周 数据处理通常在数据采集后立即进行，

14、在总时间中可忽略不计 数据采集与共振指认的时间可部分重叠,一些其他因素,水峰压制 小分子干扰 对异核实验影响不大 温度：控温装置 分辨率、信噪比与时间 分辨率：间接维点数 实验时间与间接维点数成正比 信噪比与累加次数的平方根成正比 实验时间与累加次数成正比,最新的进展,谱仪：超低温探头 提高灵敏度24倍 TROSY（横向弛豫优化谱） 在700MHz以上高场谱仪中可以显著减小线宽，从而可用于测定更大分子量的蛋白质 RDC（残余偶极耦合） 得到化学键的空间相对取向信息 自动化方法 显著加速结构计算进程,使用的软件,NMRPipe 数据处理/bax/s

15、oftware/NMRPipe/ NMRView 指认分析 CYANA结构计算 500 Euro http:/www.las.jp/prod/cyana/eg/ TALOS基于化学位移预测主链二面角 (NMRPipe的一部分) /NMRPipe/talos/ SANE基于结构的NOE自动指认J Biomol NMR, 2001 19(4) 321-9 Amber 分子动力学模拟。用于结构优化 $400 / PROCHECK-NMR 结构分析与评价http:/www.biochem.ucl.ac.uk/

16、roman/procheck_nmr/procheck_nmr.html MOLMOL 结构分析与绘图http:/hugin.ethz.ch/wuthrich/software/molmol/,其他软件,数据处理 Felix $? AZARA Free http:/www.bio.cam.ac.uk/azara/ PROSA (Free?) http:/guentert.gsc.riken.go.jp/Software/Prosa.html 指认分析 Felix $? XEASY $ 200 http:/hugin.ethz.ch/wuthrich/software/xeasy/index.h

17、tml Sparky Free /home/sparky/ CARA Free http:/www.nmr.ch 结构计算 CNS Free / XPLOR Free /xplor/ XPLOR-NIH Free /xplor-nih/ 分子绘图 PyMol Free MolScript Free http:/www.avatar.se/molscript/ RasMol Free / VMD Free /Research/vmd/,NMR结构解析流程,生物信息学和生物化学分析 样品制备（蛋白质表达纯化，标记） 核磁共振数据收集 化学位移指认 NOE指认 结构计算,核磁共振初步鉴定,二级结构分析,参考书,NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wuthrich K., Wiley Press, 1986 NMR