盐度胁迫对黄鳍鲷抗氧化酶和ATP酶影响的研究技术总结.ppt

1、“盐度胁迫对黄鳍鲷抗氧化酶和ATP酶影响的研究”项目技术总结,2013年8月5日,ATP酶是一类分布广泛的膜结合蛋白酶，其中Na+/K+-ATP酶在Na+/K+泵中发挥重要作用，参与细胞内外Na+与K+的主动跨膜转运，维持细胞内高K+、细胞外高Na+的离子浓度梯度；而Ca2 +/Mg2 +-ATP酶是将细胞内Ca2+泵出细胞外，维持细胞内低Ca2+水平。在养殖水体盐度发生变化的过程中，鳃和肾脏的ATP酶维持细胞内外渗透压平衡，可以作为离子转运能力的生物学指标。鱼类体内的的抗氧化系统是生物体抵御环境胁迫的第一道屏障，盐度胁迫鱼类的抗氧化酶活力。目前己有研究表明，盐度胁迫能引起鱼类鳃和肾脏的ATP

2、酶和肝脏抗氧化酶活力变化。盐度胁迫对鳃和肾脏ATP酶和肝脏抗氧化酶活力的影响可作为盐度对鱼体健康影响程度的指标。,黄鳍鲷(Sparus latus )属鲷科（Sparidae），鲷属(Sparus)，广泛分布于红海、阿拉伯海、印度洋、西太平洋沿岸，我国东南沿海均有分布。黄鳍鲷生活于近岸海域及河口湾，杂食性，是一种重要的经济鱼类。国内外学者在黄鳍鲷的消化酶、配合饲料以及病害等方面进行了大量的研究。但盐度变化对黄鳍鲷幼鱼鳃和肾脏ATP酶及肝脏抗氧化酶活力影响的研究未见报道。为了分析黄鳍鲷对盐度变化的适应能力，探讨盐度变化对黄鳍鲷胁迫的程度，同时也为黄鳍鲷的淡化及半咸水养殖提供一些基础资料，本项目开

3、展了不同盐度对黄鳍鲷幼鱼的存活率、鳃和肾脏Na+/K+、Ca2+/Mg2+-ATP酶及肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力影响的研究。,1 材料与方法 1.1实验材料 黄鳍鲷幼鱼购自福建诏安沿海，在实验环境中采用自然海水(盐度20)养殖28d后，随机挑选健康、体表无受伤、个体大小均匀的幼鱼用于实验研究，用于鳃ATP酶和肝脏抗氧化酶活力实验的幼鱼全长363mm，体重0.590.15g，用于肾脏ATP酶实验的幼鱼全长11310mm，体重36.703.25g。采用140 L红色塑料桶作为实验容器。实验用水为砂滤天然海水与曝气自来水按比例配制的不同盐度的海水。连续充气，每天换等盐度海

4、水一次，水温181。实验期间，分别于8:00和17:00投喂饲料，取样前22h停止投喂。各组实验开始前进行生化测定，在测定的指标没有显著差异时开始实验。,1.2 实验方法 设4个实验组，其中以自然海水组（盐度20)为对照组，再设盐度分别为15、10、5和淡水的4个处理组，每组3个平行，每平行放养30尾鱼，起始为自然海水养殖。根据预实验结果，盐度15由自然海水直接过渡并计时。盐度10、5和淡水过渡过程为：采用逐级降低盐度的方法，设置每48h降低一级（盐度由20105淡水共4级），按淡水、5、10的顺序，每组间隔48h，按48 h盐度下降一级的速度分别将盐度降至淡水、5和10，当达到各组相对应的盐

5、度时开始计时，当各组分别实验至24、48、72、96和120h 时，各组随机抽取6尾幼鱼用于生化测定。因淡水组在实验开始计时的24h内有死亡，所以增设在盐度5中停留120h后过渡到淡水的实验组。,1.3 酶活力测定 用MS222 (200 mg/ L) 将黄鳍鲷幼鱼麻醉后，将实验鱼置于冰盘上解剖，取出鳃、肝脏和肾脏后，用预冷0.9 % 生理盐水快速冲洗，并用吸水纸小心吸干。测定前先在冰盘内将样品剪碎，各组样品分别加入9倍体积(W/V)预冷生理盐水，在玻璃匀浆器中匀浆，于Biofuge Stratos冷冻离心机4、2500rmin-1离心10min。根据需要，将上清液稀释后作酶活力及总蛋白测定。

6、 酶活力采用南京建成试剂盒检测，相应操作参照说明书进行。Na+/K+、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力采用比色法，活力单位定义为每小时在含有1毫克蛋白的组织中ATP酶参与分解ATP产生1mol无机磷的量为1个酶活力单位，即微摩尔分子磷/毫克蛋白小时mol Pi/(mg proth)，SOD活力按黄嘌呤氧化酶法，活力单位定义为每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50 %时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U)，CAT活力采用比色法，活力单位定义为每分钟分解1mol 的过氧化氢即为1个酶活力单位(U) (南京建成试剂盒)。,1.4 数据分析与统计方法 生化测定所得数据采用SPSS13.

7、0统计软件包中的一元方差分析(One-way analysis of variance)和Duncan法进行多重比较，分析各实验组与对照组之间及同一组不同时间相邻两组间的差异，P0.05为差异显著，所有的数据均以平均值标准误差(Mean S.D)来表示。,2 结果与分析 2.1盐度对黄鳍鲷幼鱼存活的影响 盐度15、10和5组在120 h的实验过程中均未出现反常现象，摄食正常，没有死亡。淡水组实验开始后的第一天能摄食，但摄食量明显下降，后不摄食，在96h内死亡率为34%；120h淡水组在96h内没有死亡。濒死的鱼体色发白、狂燥不安、急速的上下游动、最后沉底侧卧死亡。,图1.不同时间黄鳍鲷幼鱼鳃N

8、a+/K+-ATP酶活力 注：图标上方有“*”，表示与同一时间对照组存在显著性差异(P0.05)，下同。,2.2 盐度对黄鳍鲷幼鱼鳃的Na+/K+-ATP酶活力的影响 实验开始前各组幼鱼鳃的Na+/K+-ATP酶活力经检验没有显著差异(P0.05)，由图1可见，随实验时间的不断延长，各实验组鳃Na+/K+-ATP酶活力变化趋势为：盐度15和10组没有显著变化，与对照组没有显著差异(P0.05)；盐度5组先升后降到对照组水平，在24h显著高于对照组(P0.05)；淡水组升高后一直处在较高的水平，72和96h显著高于对照组(P0.05)，120h淡水组升高后下降，48和72h显著高于对照组(P0.

9、05)。,2.3 盐度下降速度对黄鳍鲷幼鱼鳃Ca2+/Mg2+-ATP酶活力的影响 实验开始前幼鱼鳃Ca2+/Mg2+-ATP酶活力经检验没有显著差异(P0.05)，由图2可见随时间的不断延长，各组鳃Ca2+/Mg2+-ATP酶活力变化趋势为：盐度15和10组没有显著变化，与对照组没有显著差异(P0.05)；盐度5组先升高后降到比对照组略高一些的水平，仅24h显著高于对照组(P0.05)；淡水组没有显著变化；120h淡水组先升高后降到对照组水平，在24 h显著高于对照组(P0.05)。,图2.不同时间黄鳍鲷幼鱼鳃Ca2+/Mg2+-ATP酶活力,图3. 不同时间黄鳍鲷幼鱼肝脏SOD活力,2.4

10、 盐度下降速度对黄鳍鲷幼鱼肝脏SOD活力的影响 实验开始前幼鱼肝脏SOD活力经检验没有显著差异(P0.05)，由图3可见随时间的不断延长，各组黄鳍鲷幼鱼肝脏SOD活力变化趋势为：盐度15、10和5组没有显著变化，与对照组没有显著差异(P0.05)；淡水组呈波动性变化，24、48、72和96h显著高于对照组(P0.05)；120h淡水组先升高后一直处于高位，24、72和96h显著高于对照组(P0.05)。,2.5 盐度下降速度对黄鳍鲷幼鱼肝脏CAT活力的影响 实验开始前幼鱼肝脏CAT活力经检验没有显著差异(P0.05)，由图4可见随时间的不断延长，各实验组黄鳍鲷幼鱼肝脏CAT活力变化趋势为：盐度

11、15与对照组没有显著差异(P0.05)；盐度10组先下降后在72h达到最高后再下降到对照组的水平，24h显著低于对照组(P0.05)；盐度5组先下降后在72h达到最高后逐渐恢复到在对照组的水平，在24h显著低于对照组(P0.05)；淡水组下降后对照组的水平附近波动，48h显著低于对照组(P0.05)；120h淡水组下降后一直在低位波动，在24和72h显著低于对照组(P0.05)。,图4. 不同时间黄鳍鲷幼鱼肝脏CAT活力,图5. 不同时间黄鳍鲷幼鱼肾脏Na+/K+-ATP酶活力,2.6 盐度对黄鳍鲷幼鱼肾脏的Na+/K+-ATP酶活力的影响 实验开始前各组幼鱼肾脏的Na+/K+-ATP酶活力经

12、检验没有显著差异(P0.05)，由图5可见，随实验时间的不断延长，各实验组肾脏Na+/K+-ATP酶活力变化趋势为：盐度15、10组没有显著变化，与对照组没有显著差异(P0.05)；盐度5先升高后下降，48和96h显著高于对照组(P0.05)。淡水组先升高后下降，24、48和96h显著高于对照组(P0.05)。,2.7 盐度下降速度对黄鳍鲷幼鱼肾脏Ca2+/Mg2+-ATP酶活力的影响 实验开始前各组幼鱼肾脏的Ca2+/Mg2+-ATP酶活经检验没有显著差异(P0.05)，由图6可见，随实验时间的不断延长，各实验组肾脏Ca2+/Mg2+-ATP酶活力变化趋势为：盐度15、10组没有显著变化，与

13、对照组没有显著差异(P0.05)；盐度5先升高后下降，48h显著高于照组(P0.05)。淡水组呈波动性变化，24和96h显著高于对照组(P0.05)。,图6.不同时间黄鳍鲷幼鱼肾脏Ca2+/Mg2+-ATP酶活力,3讨论 3.1 盐度下降速度对黄鳍鲷幼鱼存活的影响 不同盐度其渗透压相差很大，然而不同的鱼或生存在不同盐度环境中的同一鱼类体液含盐浓度相差不大，约为7左右，鱼类为了维持体内渗透压的稳定，必须进行渗透压的调节，鱼类调节渗透压能力的大小，决定了它们对盐度的适应范围。鱼类对盐度的适应过程分为2个阶段: 一是在短期内，盐度变化刺激鱼体渗透调节生理机制的改变; 二是渗透压向变化前状态的逐渐恢复

14、的过程，维持鱼类自身内环境稳定，但当超出其适应范围则体内生理状态紊乱，行为及摄食异常，由于耗能过多，机体衰竭，最终出现死亡。 本实验中的对照组、盐度15、10、和5组在120 h的实验过程中均未出现反常现象，摄食正常，没有死亡，说明盐度胁迫在鱼体的承受范围之内，鱼体通过自身的调节维持了内环境稳定，而淡水组出现死亡，表明淡水的胁迫己超出其调节范围，实验鱼不摄食及死亡时所出现的症状也证实了这一点，而不同淡水组之间开始出现死亡的时间和停止摄食的时间不同表明了黄鳍鲷对淡水仍有一定的适应能力。,3.2 盐度下降速度对黄鳍鲷幼鱼Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力的影响 ATP酶是机体

15、中离子调控的重要蛋白酶。鳃是硬骨鱼对离子调控的重要器官之一。当盐度发生改变时，机体长期进化和适应所建立的内环境相对的动态平衡被打破。为了再次建立起新的平衡，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力将被激活，己有的研究表明，当盐度发生改变时，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力先升后降，使鱼体的内环境形成一个新平衡，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力升高时间与建立新平衡所需的时间有关，也与所受盐度胁迫的强度有关，盐度胁迫越大，建立新平衡的所需的时间越长，Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力升高的时间也越长，而当超出机体

16、的耐受范围时这种平衡则无法建立并导致鱼体死亡。,本次实验结果显示，盐度15和10组黄鳍鲷幼鱼鳃、肾脏的Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力随时间的不断延长没有显著变化，与对照组没有显著差异(P0.05)，说明由盐度20降到盐度15、盐度20降到盐度10时，黄鳍鲷幼鱼的体内的渗透压没有完全失去平衡，只需在原有的基础上进行适当的调整，盐度20可直接过渡到盐度10。盐度5组鳃Na+/K+-ATP酶活力先升后降到对照组水平，在24h显著高于对照组(P0.05)，鳃Ca2+/Mg2+-ATP酶活力先升高后降到比对照组略高一些的水平，仅24h显著高于对照组(P0.05)，肾脏Na+/K

17、+-ATP酶活力先升高后下降，48和96h显著高于对照组(P0.05)，肾脏Ca2+/Mg2+-ATP酶活力先升高后下降，48 h显著高于照组(P0.05)，可见在盐度5时黄鳍鲷幼鱼体内的渗透压失去平衡，需要建立新的平衡。淡水组鳃Na+/K+-ATP酶活力升高后一直处在较高的水平，72和96h显著高于对照组(P0.05)，鳃Ca2+/Mg2+-ATP酶活力淡水组没有显著变化，肾脏的Na+/K+-ATP酶活力先升高后下降，24、48和96h显著高于对照组(P0.05)，肾脏的Ca2+/Mg2+-ATP酶活力呈波动性变化，24和96h显著高于对照组(P0.05)；120h淡水组鳃Na+/K+-AT

18、P酶活力升高后下降，48和72h显著高于对照组(P0.05)，鳃Ca2+/Mg2+-ATP酶活力先升高后降到对照组水，在24平h显著高于对照组(P0.05)，说明黄鳍鲷幼鱼在淡水中也须建立新的渗透压平衡，96h后出现死亡说明在淡水中渗透压失衡与盐度5相比更为严重，盐度胁迫强度由强到弱分别为淡水、盐度5和盐度15、10。在生化测定中一般要求实验鱼不能发生死亡，淡水组在96h内死亡率为34%，淡水组取样期间幼鱼死亡影响到了实验结果，淡水组鳃Ca2+/Mg2+-ATP酶活力没有显著变化的原因就在于此。,3.3 盐度下降速度对黄鳍鲷幼鱼肝脏SOD和CAT活力的影响 不同鱼类的盐度胁迫实验中SOD和CA

19、T的活力的变化趋势有些不同，但我们认为抗氧化酶活力在盐度胁迫时整个变化趋势为下降、上升再下降到对照组水平。响应的时间越长，清除活性氧自由基的时间越长，说明胁迫压力越大。当盐度胁迫太大，产生的活性氧自由基超出抗氧化酶最大的清除能力时，抗氧化酶活力的变化为下降、上升再下降到低于对照组水平（产生中毒性的酶活力抑制），最终导致鱼体死亡。各研究中所描述的SOD和CAT的活力的变化可能是整个趋势变化中的一部分，因此变化趋势会有所不同。,本次研究结果表明，淡水组呈波动性变化，24、48、72和96h显著高于对照组(P0.05)；盐度10组CAT活力先下降后在72h达到最高后再下降到对照组的水平，说明在96h内完成了整个响应过程；盐度5组先下降后在72h达到最高后逐渐恢复到在对照组的水平，说明在96h仍处在上升阶段；淡水组下降后在对照组的水平附近波动，48h显著低于对照组(P0.05)；120h淡水组下降后一直在低位，说明在96h时还处在下降阶段，尚未产生明显的诱导效应。整个响应的时间由长到短为淡水组、盐度5组、盐度10组和盐度15组，盐度胁迫强度由强到弱分别为淡水组、盐度5组和盐度10组和盐度15组。与SOD活力相比