基因工程的基本操作程序

1、1.2 基因工程的基本操作程序,专题1 基因工程,（1）目的基因的获取,（2）基因表达载体的构建,（3）将目的基因导入受体细胞,（4）目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作程序主要包括四个步骤：,一、目的基因的获取,（一）目的基因：,主要是_的基因,编码蛋白质,如：与生物抗逆性相关的基因 与优良品质相关的基因 与生物药物和保健品相关的基因 与毒物降解相关的基因 与工业所需酶相关的基因,也可是具有调控作用的因子（如增强子等）,（二）目的基因的获取方法：,1、从基因文库中获取,（1）基因文库：,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为

2、基因文库。,（2） 基因文库的种类：,部分基因文库,基因组文库,基因组文库：,包含了一种生物的所有基因，其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,部分基因文库：,包含了一种生物的部分基因， 如cDNA文库。,提取某种生物的全部DNA,用适当的 限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,基因组文库的构建方法：,cDNA文库的构建方法-反转录法,某种生物的单链mRNA,合成互补DNA,形成双链DNA（即cDNA）,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,逆转录酶 （反转录酶）,DNA聚合酶,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,

3、编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,编码区: 能编码蛋白质的序列 非编码区: 不能能编码蛋白质的序列（含基因表达的调控序列）,知识补充：,真核细胞的基因结构,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,基因组文库和cDNA文库比较：,（3）从基因文库中得到目的基因的方法：,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能

4、 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,2、利用PCR技术扩增目的基因,（1）PCR技术：,是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，短时间内大量扩增目的基因。,（2）原理：,DNA双链复制,（3）条件：,DNA模板 引物（一对） 4种脱氧核苷酸 Taq酶（耐高温的DNA聚合酶） 缓冲液,（4）过程：,变性、退火、延伸三步曲, 变性：,双链DNA单链DNA,55 60, 退火：,90 95,引物与单链DNA模板结合(碱基互补配对), 延伸：,70 75,Taq酶的作用下，从引物起始进行互补链的延伸,（5）结果：,每循环一次，目的基因可增加一倍， 呈指数

5、形式（2n）扩增。,PCR扩增仪,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,4种脱氧核苷酸,模板、能量、DNA聚合酶,DNA在高温变性 解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,3、人工合成法,如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,1、构建表达载体的目的：, 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以 遗传给下一代； 使目的基因能够表达和发挥作用。,2、基因表达载体的构成及作用：,复制原点,目的基因,启动子,终止子,标记基因,启

6、动子：,位于基因首端的一段有特殊结构的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位； 作用：驱动基因转录出mRNA,终止子：,位于基因尾端的一段有特殊结构DNA片断。 作用：使转录终止,标记基因：,为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来（如抗生素抗性基因）。,注意： 启动子与终止子不同于起始密码和终止密码 启动子与终止子位于DNA上，是DNA片段，与基因的转录有关。 起始密码和终止密码位于mRNA上， 是3个相邻的碱基，与翻译（蛋白质的合成）有关。,克隆载体与表达载体的构成： 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片 段。表达载体在克隆载体基础上增加了启动 子、终止

7、子，启动子、终止子对于目的基因 表达必不可少。,三、将目的基因导入受体细胞,1、转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,2、常用的转化方法：,（1）导入植物细胞的方法：, 农杆菌转化法（最常用）,a. 农杆菌：,土壤中的一种微生物，自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,b.农杆菌转化法的原理：,植物受伤时，伤口处细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌，农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上,c. 过程：,优点：经济、有效, 基因枪法,单子叶植物常用的方法

8、，成本较高。, 花粉管通道法,简便经济 （我国转基因抗虫棉）,（2）导入动物细胞的方法：, 常用方法：,显微注射法, 常用的受体细胞：,受精卵,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物, 流程：,（3）导入微生物细胞的方法：, 原核生物特点：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少, 方法：,用Ca2+（或CaCl2溶液）处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。,四、目的基因的检测与鉴定,1、转基因生物DNA上是否插入了目的基因,（1）方法：,DNA分子杂交技术,（2）过程：,. 提取转基因生物的基因组DNA . 用放射性同位标

9、记的目的基因的DNA片段 做探针，与转基因生物的基因组杂交， 若显示出杂交带，表明目的基因已插入染 色体DNA中。,2、目的基因是否转录出mRNA,（1）方法：,分子杂交技术,（2）过程：,. 提取转基因生物的mRNA . 用放射性同位标记的目的基因的DNA片段 做探针，与转基因生物的mRNA杂交， 若显示出杂交带，表明目的基因转录出 mRNA。,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,（1）方法：,抗原抗体杂交,（2）原理：,抗原与抗体的特异性结合,（3）过程：,. 提取转基因生物的蛋白质 . 用针对目的基因表达的蛋白质（抗原）的 抗体（放射性标记），与转基因生物的蛋 白质（抗原）杂交，若显示出杂

10、交带，表 明目的基因已形成相应的蛋白质。,除了上述分子水平的鉴定，有时还需进行个体生物学水平的鉴定：,比如做抗虫、抗病的接种实验， 以确定是否有抗性以及抗性的程度； 或对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同,【特别提示】 关注“操作程序”中的四个易混点 (1)目的基因的插入位点不是随意的。目的基因 应插入到启动子与终止子之间的部位。 (2)目的基因与载体相连接时，可能出现3种连接 方式，如目的基因目的基因、目的基因 载体、载体载体。为了防止目的基因或载 体自连，基因工程中常用2种不同的限制酶对 目的基因和载体进行切割，并保证目的基因 的定向连接（启动子在其前，终止子在其 后，保证