天津大学-生物化学-课件--第十二章4-5节-1

1、第四节 RNA的生物合成,一、DNA指导下的RNA合成转录 二、RNA指导下的RNA合成RNA复制 三、RNA指导下的DNA合成逆转录,一、DNA指导下的RNA合成转录1,转录：在DNA指导下RNA的合成。此过程包括RNA链的起始、延伸、终止等步骤。 转录要涉及两方面：一是RNA合成的酶学过程；二是RNA合成的起始信号和终止信号。 模板链：转录的模板DNA链，也叫反义链或负链。 编码链：与模板链对应的链，也叫有义链或正链。 转录的起始是由DNA的启动子（promter）区控制的，而控制终止的部位则称为终止子(ferminafor)。,一、DNA指导下的RNA合成转录2,（一）大肠杆菌RNA聚合

2、酶 （二）RNA聚合酶催化的转录过程 （三）RNA的转录后加工,（一）大肠杆菌RNA聚合酶1,+,核心酶,（一）大肠杆菌RNA聚合酶1,A,C,P,T,P,C,P,G,A,P,P- P- P,OH,5,3,C,P,G,P,P,P,P,OH,U,DNA指导下的RNA合成,（二）RNA聚合酶催化的转录过程,1RNA聚合酶与模板DNA结合 2起始 3延伸 4终止,1RNA聚合酶与模板DNA结合1,RNA聚合酶结合到模板DNA的特定位置上,1RNA聚合酶与模板DNA结合2,这一特定部位有RNA聚合作用的起动基因，即启动子,TTGACA,AACTGT,TATAAT,ATATTA,35（识别位）,10（P

3、ribnow框）1,起始部位,DNA,5,3,原核生物启动子结构,1RNA聚合酶与模板DNA结合3,双链DNA局部解开,2起始1,磷酸二酯键的形成1,2起始2,A,C,P,T,P,C,P,G,A,P,P- P- P,OH,5,3,C,P,G,P,P,P,P,OH,U,磷酸二酯键的形成2,3延伸1,恢复的DNA双螺旋,mRNA,5,延长阶段1,在DNA的一条链上，通过碱基配对合成RNA链，解链区沿DNA移动,3延伸2,延长阶段2,解链区到达基因终端,4终止1,终止阶段1,RNA和RNA聚合酶从DNA上脱落,4终止2,终止阶段2：原核生物转录中止信号及产物,AGCCCGC,TCGGGCG,GCGG

4、GCT,CGCCCGA,TTTTTTTT,AAAAAAAA,反义链,有义链,DNA,AAAAAAAA,TTTTTTTT,UUUUU,U,U,CGGGCG,GCCCGC,A,5,反义链,有义链,DNA,RNA产物,5原核生物的转录过程,（三）RNA的转录后加工,在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物往往需要经过一系列的变化，包括链的裂解、5端与3端的切除和特殊结构的形成，碱基修饰和糖苷键的改变，以及拼接等过程。使其能转变为成熟的RNA分子，此过程总称为RNA的成熟或转录后加工。,（三）RNA的转录后加工,1原核生物RNA的转录后加工 2真核细胞RNA的转录后加工,1原核生物RNA转录后加工1（

5、mRNA）,原核生物的mRNA大多不需加工，一经转录即可直接进行翻译。,1原核生物RNA转录后加工2（rRNA1）,大肠杆菌共有7个rRNA的转录单位，它们分散在基因组的各处。,1原核细胞RNA转录后加工2（rRNA2）,P16S,P23S,P5S,16S,23S,5S,细菌rRNA的形成,1原核生物RNA转录后加工3（tRNA1）,大肠杆菌染色体基因组共有tRNA基因约60个，这个数字远大于按变偶假说所要求的反密码子数。即：某些反密码子可能不只一个tRNA分子，或某些tRNA基因不是一个拷贝。tRNA基因大多成簇存在。tRNA转录时首先成为tRNA前体。,1原核生物RNA转录后加工3（tRN

6、A2）,5ppp,转录,tRNA前体,tRNA,OH3,5ppp,OH3,OH3+核苷酸降解产物,降解至单核苷酸,p,成熟的tRNA,U Gm2G Ai6A等,修饰,tRNA的形成,2真核生物RNA转录后加工1（rRNA1）,2真核生物RNA转录后加工2（rRNA2）,18S,5.8S,28S,45S,甲基化作用,核酸内切酶,18SRNA,5.8SRNA,28SRNA,真核生物rRNA前体的加工,2真核生物RNA转录后加工3（rRNA3）,真核生物rRNA的生成与成熟,45S 5S,41S32S 5S 20S,32S 5S,细胞核,核仁,细胞质,28S 5.8S,18S,5S,28S 5.8S

7、,18S,核蛋白体,2真核生物RNA转录后加工4（tRNA1）,在酶的催化下，切掉部分核苷酸分子（包括14分子的UMP、7分子CMP、8分子GMP及少于1分子的AMP）。 tRNA前体分子被修饰：其一是有些尿嘧啶残基转变为拟尿嘧啶或二氢尿嘧啶残基；其二是甲基化作用。此变化是在甲基转移酶的催化下，由s-腺苷蛋氨酸供给甲基，在多核苷酸水平上进行。,从tRNA前体转变到tRNA的过程,2真核生物RNA转录后加工5（tRNA2）,tRNA的生成,细胞核,核仁,细胞质,tRNA基因,转录,5,切断,tRNA前体,nCH3 拟尿苷生成,tRNA,2真核生物RNA转录后加工6（mRNA1）,两者都为不均一分

8、子 两者碱基组成上有部分相似 两者3末端都有多聚腺苷酸尾部；5端连接有GMTP（7-甲基鸟苷）的帽子,（1）细胞核中的不均一核RNA（HnRNA）可能是mRNA的前体,因为：,2真核生物RNA转录后加工7（mRNA2）,5端形成特殊的帽子结构（M7G5PPP5NmpNp-） 在链的3端切断并加上多聚腺苷酸（polyA）尾巴 通过拼接除去由内含子转录来的序列 链内部核苷被甲基化,（2）HnRNA转变成mRNA的加工过程：,2真核生物RNA转录后加工8（mRNA3）,卵清蛋白基因产生mRNA的过程：,转录,1 2 3 4 5 6 7,A B C D E F G,卵清蛋白基因(7700个核苷酸),1

9、 2 3 4 5 6 7,A B C D E F G,L,L,5,3,加帽子和尾巴,1 2 3 4 5 6 7,A B C D E F G,L,5,3,内含子RNA的除去 和拼接作用,12345 6 7,L,CAP,PolyA尾,成熟的mRNA,1872个核苷酸,2真核生物RNA转录后加工9（mRNA4）,2真核生物RNA转录后加工10（帽子结构形成过程）,GTP,Pi,pppN1N2N3,G5 ppp5 N1N2N3 ,pppN1N2N3 ,RNA三磷酸酶,Pii,mRNA鸟苷酸转移酶,S-腺苷甲硫氨酸,m7G5 ppp5 N1N2N3 ,S-腺苷高半胱氨酸,mRNA(鸟嘌呤-7-)甲基转移

10、酶,mRNA(核苷-2-)甲基转移酶,S-腺苷甲硫氨酸,S-腺苷高半胱氨酸,m7G5 ppp5 N1 mN2N3 ,S-腺苷甲硫氨酸,S-腺苷高半胱氨酸,m7G5 ppp5 N1 mN2mN3 ,mRNA(核苷-2-)甲基转移酶,二、RNA指导下的RNA合成RNA复制,病毒正链（具mRNA功能）,pppG,5 ,3 ,OH,5 ,5 ,3 ,OH,复制中间体,5 ,3 ,3 ,新合成的负链,病毒正链为模板,复制酶,5 ,三、依靠反转录的DNA生物合成1,1970年Temin和Baltimore同时分别从致癌RNA病毒中发现RNA指导的DNA聚合酶。由于它催化遗传信息从RNA流向DNA，与转录作

11、用正好相反，故称为反转录酶或逆转录酶。 病毒感染细胞后，通过逆转录酶生成与病毒RNA碱基序列互补的DNA，并整合到宿主细胞的染色体DNA中。此后，在宿主细胞内，这段插入的DNA经转录生成相应的mRNA，再转译成病毒专一的蛋白质。,三、依靠反转录的DNA生物合成2,RNA,3 ,5 ,依赖于RNA的DNA聚合酶,RNA,3 ,5 ,核糖核酸酶H,5,3 ,5,3 ,cDNA,依赖DNA的DNA聚合酶,cDNA,杂种分子,3,5 ,5,3 ,双链DNA,新合成的双链DNA整合到寄主染色体DNA中,第五节 基因的重组与DNA“克隆”,DNA重组技术是指将不同的DNA片段按人们的设计方案定向地连接起来

12、，并在特定的受体细胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。 从某种意义上来说，DNA重组技术也可理解为基因工程，也是使生物基因结构得到改造的技术。,第五节 基因的重组与DNA“克隆”2,一、DNA重组技术的用途 二、重组中所用的酶和载体 三、重组的大致步骤,一、DNA重组技术的用途,1利用DNA重组技术大量生产一些在正常组织代谢中产量很低的多肽物质，如多肽激素、多肽抗生素、酶类、抗体及各种肽类。 2定向地改造生物基因组结构，使其具有的某些有经济价值的功能得以成百倍地提高。 3将DNA重组技术应用于基础研究。如在基因组结构及基因组功能调节的研究。,二、重组中的酶及载体,（一）

13、DNA体外重组中常用的酶 （二）载体,（一）DNA体外重组中常用的酶1,1限制性内切酶 2T4DNA连接酶 3大肠杆菌 DNA聚合酶I 4大肠杆菌DNA聚合酶大片段（klenow片段） 5T4DNA聚合酶 6T4多核苷酸激酶 7反转录酶 8细菌碱性磷酯酶 9核酸酶S1 10脱氧核糖核酸酶I 11polyA聚合酶,（一）DNA体外重组中常用的酶2,由同一个限制性内切酶切断得到的任何两个DNA片段的粘性末端都可以互相配对，然后每条DNA链的断开部分再通过DNA连接酶所产生的磷酸二酯键连接起来。,1.限制性内切酶1,（一）DNA体外重组中常用的酶2,1.限制性内切酶2,*,*,（一）DNA体外重组中

14、常用的酶2,*,*,*,*,*,*,（一）DNA体外重组中常用的酶2,1.限制性内切酶3,（一）DNA体外重组中常用的酶3,2T4DNA连接酶：是从噬菌体T4 感染过的大肠杆菌中分离出来的。此酶由一条肽链组成，分子量6800，催化DNA上的3-OH与5-P末端之间的磷酸二酯键的形成，既可催化粘性末端又可催化平头末端间的连接。催化过程需ATP和Mg2+ 3大肠杆菌 DNA聚合酶I：5-3聚合酶活力 4大肠杆菌DNA聚合酶大片段（klenow片段）：将大肠杆菌DNA聚合酶用枯草杆菌素来降解，形成的产物中有一个分子量为76,000的多肽，即为此酶。它失去了5-3外切酶活力，其它功能与DNA聚合酶相同

15、，此酶用途很广。,（一）DNA体外重组中常用的酶4,5T4DNA聚合酶：它存在于噬菌体T4中，与klenow片段相似，5-3聚合酶活力比大肠杆菌DNA酶多200倍。 6T4多核苷酸激酶：此酶是从T4感染过的大肠杆菌中分离出来的，它催化ATP上的-P转移到DNA或RNA的5-OH上，所以可用来标记DNA或RNA。 7反转录酶：合成cDNA的第一条链，具有5-3DNA聚合酶活力。,（一）DNA体外重组中常用的酶5,8细菌碱性磷酯酶：十分耐热，可将DNA或RNA的5-P除去，反应常在600C以上进行，以抑制反应中其他内切酶。 9核酸酶S1：催化单链DNA降解，产生5-P结尾的单核苷酸或寡核苷酸，用以

16、切除双链cDNA上的发夹形结构上的单链凸环。 10脱氧核糖核酸酶I：是一种内切酶，降解双链或单链DNA，产生以5-P结尾的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。 11polyA聚合酶：催化将AMP加到RNA的3-OH末端，形成3-polyA的反应。,（二）载体（总）,1定义 2载体必须具备的条件 3目前常用的载体,1定义,外源DNA片段要进入受体细胞，并在其中进行复制与表达，必须有一个适当的运载工具将其带入细胞内，并载着外源DNA一起进行复制与表达，这种运载工具称为载体 。,2载体必须具备如下条件,（1）在受体细胞中，可以独立进行复制，所以其本身必须是一个复制单位，而且插入外源DNA后不会影响其本身的复

17、制能力。 （2）易于鉴定、筛选。即易将带有外源DNA的重组体与正常的载体区别开。 （3）易于引入受体细胞。,3目前常用的载体1（总）,（1）质粒：是比较小的双链DNA环形分子，在细菌和酵母中都存在。 （2）噬菌体：包括噬菌体、装配型质粒（噬菌体改造）及 M13噬菌体（是一种含有单链DNA的噬菌体）。,3目前常用的载体1（总）,3目前常用的载体2（噬菌体为载体）,DNA,用限制酶除去中间一段,太小不能被包装,与外源DNA连接,重组DNA分子的体外包装,带有外源DNA的噬菌体,三、重组的步骤1,（1）外源DNA与载体的连接，形成重组DNA （2）通过转化（或感染）将重组DNA引入受体细胞 （3）筛

18、选出含有重组体的阳性克隆,三、重组的步骤1DNA与载体相连接,简明P235图1213、1214,载体,外源基因,三、重组的步骤2转化与筛选,含有不同插入DNA片断的质粒,细菌细胞,转化并置于有抗生素的介质,带有抗药性质粒的细菌才生长,鉴定携有DNA片断克隆的的菌落，并扩大培养,质粒DNA纯化,三、DNA表达的一般步骤1,1目的基因的取得 2外源DNA与载体的连接，形成 重组DNA 3将重组DNA引入受体细胞 4重组体的筛选 5表达,三、DNA表达的一般步骤2,待插入的外源DNA,质粒载体,连接,重组体DNA,经转化作用或病毒感染引入宿主细胞,宿主染色体,筛选出具有重组体DNA的细胞,克隆,DN

19、A重组体的构建和克隆,1目的基因的取得分离法、合成法,（1）DNA片段的直接提取 （2）用噬菌体或质粒从宿主细胞中将目的基因携出 （3）使用相应的mRNA分离基因,2外源DNA与载体连接形成重组DNA1,（1）粘性末端连接 （2）平头末端连接 （3）在DNA片断末端加上均聚寡核苷酸后连接，在3-OH端由末端核苷酸转移酶添加单核苷酸的反应 （4）用接头连接：适用于粘端与平端DNA之间的连接,外源DNA与载体的DNA之间的连接方式：,2外源DNA与载体连接形成重组DNA2,（1）粘性末端连接,T,G,C,A,T,G,C,A,ACG,T,GCA,T,E.coli质粒,限制酶,TGCA,ACGT,TGCA,ACGT,限制酶,ACG,T,GCA,T,GCA,T,混合、退火 DNA连接酶连接,重组体DNA,T,G,C,A,T,G,C,A,T,G,C,A,T,G,C,A,2外源DNA与载体连接形成重组DNA3,（2）平头末端连接,T4DNA连接酶 （DNA浓度低）,T4DNA连接酶 （DNA浓度很高）,T4DNA连接酶 （DNA浓度低）,2外源DNA与载体连接形成重组DNA4,（3）互补均聚寡核苷酸末端间的连接,5