电泳和电色谱.ppt

1、1,9 电泳和电色谱Electrophoresis and electrophoretic chromatograph,2,电泳概念,Arne Tiselius物理化学家、诺贝尔奖金获得者 定义荷电的胶体粒子在电场中的移动； 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。 因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。,3,电泳概念,电泳与色谱原理结合可以派生多种复合分离方法，如电泳色谱和电色谱。 电泳色谱：将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合 电色谱：利用 电渗作用 驱动流动相流动，分离作用主要源于 溶质在色谱固定相和流动

2、相间的分配平衡特性 多数情况下二者无严格区分，均称为电色谱,4,9.1 基础理论,电泳的简单原理 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。,5,albumin白蛋白 Globulin球蛋白 Serum血清,6,9.1.1 电泳速度,9.1.1.1 自由溶液中的电泳速度 Stokes Law（斯托克斯定律）,7,Stokes Law（斯托克斯定律）,如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的

3、 有效电荷Z 和 电位梯度E，它们与介质的摩擦阻力f相抗衡，这种抗衡服从斯托克斯定律： f = E Z e f= 6v r v是介质粘度为中半径为r的颗粒的移动速度。 但实际情况中， f还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至是介质的内渗等。,8,9.1.1 电泳速度,当电场力和黏性阻力达到平衡时，即f =f 时，荷电溶质恒速泳动 U0为电解质溶质的迁移率，是单位电场强度下的泳动速度（淌度）,9,双电层厚度 带电粒子迁移率,10,电泳迁移率,电泳迁移率（mobility）: 在电位梯度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。 其单位是cm2sec-1 V-1 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不

4、同物质的基础,11,9.1.1.2 凝胶中的电泳速度,聚丙烯酰胺凝胶的浓度,Tg 单位质量分数 Cg 交联剂质量分数 a丙烯酰胺单体质量 b交联剂单体质量 m缓冲液质量,Tg与u有关,12,凝胶电泳迁移率 u p365 Ferguson线图 当Cg一定时，凝胶电泳迁移率lg u与Tg呈线性关系。,13,电泳的大致分类,依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系统 移动界面电泳（moving boundary electrophoresis） 区带电泳（zone electrophoresis ） 稳态电泳（steady state electrophoresis ） 其中区带电泳是目前常用的电泳系

5、统。,14,区带电泳 表示在一个电场的作用下，在某一种支持介质上（或均一的缓冲液中），能将混合物分离成若干区带的电泳过程。 移界电泳（界面电泳）： 对物质只起到部分分离的作用，混合物以同一界面移动，只有最前面的成分有部分提纯的，其它则相互重叠。,15,等速电泳：在电泳达到平衡后，各区带相随，分成清晰的界面，以等速移动。它的区带没有重叠。 等电聚焦：利用各种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成pH梯度，使被分离物各自移动到其等电点处而聚成很窄的区带。,16,区带电泳的主要技术,区带电泳中的常用技术 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳,17,

6、凝胶电泳的支持介质： 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG） 由丙烯酰胺和交联剂 N，N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成； 琼脂糖凝胶： 从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1,3连接的-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D吡喃半乳糖交替形成的；,9.2 凝胶电泳,18,丙烯酰胺的聚合,丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的，通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素（引发剂）来引发该过程；以N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）为增速剂。 该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。 丙烯酰胺的化学聚合是由 过硫酸铵

7、 在碱性条件下，产生游离 氧自由基 引发单体丙烯酰胺成为自由基状态，经过一系列的自由基反应得到的聚合物；,19,影响聚合的主要因素,引发剂和增速剂的浓度： 浓度小易导致聚合速度慢； 浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在4060分钟内完成。 系统pH值： 酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果；,20,影响聚合的主要因素,温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性； 分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气 系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；,21,聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应,在使用凝胶介质的

8、电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Size sieving capacity），这种现象被称为分子筛效应（molecular sieving effect）,22,分子筛效应,图中A，B，C均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图 分子量大小依次为MA=MBMC，所带电荷量相同QA=QB=QC。,23,琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较PAGE低。,24,电泳系

9、统的基本组成,电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽 电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200600V，载体两性电解质等电聚焦电泳10002000V，固相梯度等电聚焦30008000V 外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却； 凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥； 灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子；,25,电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如PVDF膜 电泳洗脱仪：回收样品 凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果。,26,垂直电泳槽及灌胶模具,27,电泳的一般过程,28,29,SDS-聚丙烯酰胺

10、凝胶电泳（SDS-PAGE）,使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸35分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。,30,经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。 由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。,31,垂直板电泳装置,32,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电

11、泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,33,电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片,34,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,35,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,相对迁移率,36,电泳缓冲液,凝胶,水平式电泳装置,37,常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理： 由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小

12、与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。 因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。 PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳,38,电泳前的准备工作,缓冲系统的选择： 作用：保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持； 电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGE可以在任何pH进行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此，pH应限制在310之间。,39,缓冲系统的选择原则,是两种标准的对立权衡 如果缓冲液的pH选择在 远离 样品中各种蛋白的等电点，蛋白质分子所带 电荷的密

13、度大 ，电泳时间短，区带细而窄； 如果缓冲pH选择在 靠近 被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度差别大，分辨率就高； 因此，常常选择pH 8.09.5的缓冲，常用的缓冲液有Tris-甘氨酸（pH 8.39.5），Tris-硼酸(pH 8.39.3)和Tris-醋酸（pH 7.28.5）,40,离子强度的选择,离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳速度快； 但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。 一般选择缓冲液的离子强度为0.010.1 mol/L之间,41,凝胶浓度的选择,由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取

14、决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为： 非排阻性凝胶（unrestrictive gel）: 浓度0.7 1.0%的琼脂糖凝胶； 排阻性凝胶（restrictive gel）：浓度大于1%的琼脂糖凝胶和常规PAGE,42,凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置； 凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离；,43,PAGE的具体操作过程,制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌

15、胶模具灌胶； 样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（12mg/L，考染），加样（溴酚蓝）； 电泳：46小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部； 检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色灵敏度比考染高100倍、荧光探针）； 照相、凝胶干燥： 定量测定：,44,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE 主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定； 特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。,45,SDS-PAGE 的原理,蛋白质分子的解聚 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键

16、，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构； 而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。,46,因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异； 同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。,47,蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变,48,未知蛋白质分子量的测定,基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白

17、质的分子量测定； 以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；,49,9.2 凝胶电泳,9.2.1 凝胶电泳 以制备为目的的凝胶电泳多采用圆柱形凝胶柱，电泳后将凝胶切成圆片 连续洗脱法较为方便易行,50,凝胶电泳原理,在凝胶电泳过程中，不同分子量的荷电溶质在迁移过程中的泳动速度是不同的。 相对分子量较大的溶质受凝胶阻滞作用较大，泳动速度慢；相反，分子量小的溶质泳动速度较快。 经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含不同溶质的区带

18、，实现溶质间的分离。,51,凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液中溶质的相对分子量而异。 凝胶电泳的特点是凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一。,52,9.2 凝胶电泳,9.2.2 不连续凝胶电泳 用浓度不同的两层凝胶组成，上层凝胶浓度较低，孔径较大，对溶质的泳动无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩； 下层凝胶浓度较大，各组分根据其在凝胶中的迁移率的差别得到分离。 一般上层称为浓缩层，下层称为分离层。上层凝胶中溶质以等速电泳的形式泳动，得到浓缩。,53,不连续凝胶电泳形式,不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成。 上层凝胶浓度在2-3% Tg，其凝胶孔径很大，凝胶对溶质的泳动基本上无阻滞作用

19、，表现为等速泳动，溶质在此层得到浓缩； 下层凝胶浓度在5-25% Tg ，凝胶具有一定的孔径，各组分根据荷电量和迁移率的差别得到分离。 因此，上层称为浓缩层或浓缩胶；下层称为分离层或分离胶。,54,9.2 凝胶电泳,9.2.2.1 浓缩层内的等速电泳 以阴离子型溶质为例（溶质向阳极移动）,55,等速电泳的原理,在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离子（一般为强电解质离子，Cl-）； 迁移率最小的阴离子为末尾离子（一般为甘氨酸）； 电泳开始前，将含有目标蛋白质的料液加入到前导离子和末尾离子之间； 料液区的pH值高于前导离子区的pH值；,56,在前导离子区，前导离子的浓度与反离子的浓度一定时

20、，由于pH值不变，其泳动速度为一定值； 末尾离子根据其处位置的pH值所产生的解离度和离子迁移率将向阳极（带负电荷）或阴极（带正电荷）移动；,57,等速电泳的原理(续),料液中移动速度最快的组分A（pH高）首先进入前导离子区，但由于前导离子区pH值较低，溶质的 解离度减小（所带负电荷变少，pH降低），泳动速度减慢。 因此，其被排挤出前导离子区，从而在前导离子区和混合料液区交界处组分浓度增加；,58,同时，为了与反离子保持电中性，该处溶液pH值降低； 在此降低的pH值下，其它组分不能与组分A以相同的速度泳动而拖后； 随着时间的推移，所有的溶质都开始形成独自的区带，显示与该区带内的弱酸离子和反离子浓

21、度相应的pH值。,59,等速电泳的特点,各个组分间形成相互连接的独自区带，显示各自与对离子相应的pH值； 提高前导离子的浓度可以使溶质得到浓缩； 采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作间隔物，可使目标蛋白与其它蛋白质完全分离；,60,等速电泳作为独立的电泳法主要用于成分分析，在物质回收方面应用极少。 主要是由于每个区带互相连接，回收困难。 使用小分子间隔物虽然能解决这个问题但价格便宜、并且适合于用作间隔物的电解质很难找到。 此外电泳装置的散热也是难于解决的工程设计问题,61,不连续凝胶的分离操作,不连续凝胶层的上部和下部分别使用pH值不同的缓冲液，其中上部缓冲液根据待分离蛋白质等电点选

22、定。 上层浓缩层采用pH 6.8的缓冲液，下层分离层采用pH 8.3的缓冲液； 上层中，料液中蛋白质夹在前导离子和末尾离子之间在浓缩层内等速泳动，达到等速电泳状态后进入下层分离凝胶； 下层中蛋白质受到高浓度凝胶的分子筛作用，末尾离子会超过蛋白质，蛋白质依据荷电量和分子大小分离；,62,影响不连续凝胶分离的因素,缓冲液的pH值、组成 调节pH值可以改变荷电量Z； 分离胶的浓度或交联度 调节凝胶浓度可改变迁移率； 外加电压：改变 泳动速度,63,9.2 凝胶电泳,9.2.2.2 不连续凝胶电泳的数学模型 浓缩层（等速电泳） 扩散影响可以忽略不计，用平推流模型表示等速电泳过程 电场强度 电导率,64

23、,9.2 凝胶电泳,9.2.2.2 不连续凝胶电泳的数学模型 分离层 用轴向扩散模型表示分离层内的分离过程 初始和边界条件 分析解,65,9.2 凝胶电泳,9.2.2.3 分离操作及其特性 调节pH值可以改变荷电量，调节凝胶浓度可以改变迁移率，调节电压可以改变泳动速度等 蛋白质分离程度的参数 重叠度,66,等电点聚焦学习要点,理解：等电点聚焦的原理及特点,67,9.3等电聚焦电泳 isoelectric focusing electrophoresis,等电聚焦（isoelectrofocusing）, IEF 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进

24、行蛋白质的分离和分析。 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。 根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。,68,等电聚焦电泳 利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。 每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。,69,等电聚焦电泳进行过程中,等电聚焦电泳结束后,（）,（）,（）,（）,高pH,高pH,低pH,低pH,70,工作原理,蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是在某一pH时，

25、蛋白质的净电荷为0，此pH即为该蛋白的等电点（isoelectric point pI）。 蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，是一个物理化学常数。 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析,71,载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理,载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。,72,等电聚焦分离示意图,73,常规PAGE和等电聚焦电泳的区别,74,载体两性电解质和pH梯度的形成,等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立 作为载体两性电解质应

26、该具有以下特点： 应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置； 应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。,75,用于等电聚焦的主要载体两性电解质,Ampholine(瑞典LKB公司) 由许多脂肪族的 多氨基多羧基 的异构体和同系物组成，它们具有连续改变的氨基与羧基比 Servalyte (德国Serva 公司) 产品Biolyte Pharmalyte (瑞典Pharmacia 公司) 产品分为九种pH范围,76,pH梯度的形成,在没有电场时，载体两性电解质的pH值大约是该溶液pH范围的平均值，所有载

27、体两性电解质分子都荷电。 当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为0的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。,77,其次，一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到0才停止。同样的，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。 依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个pH梯度。,78,载体两性电解质在电场中形成pH梯度的模式图,79,水平等电聚焦电泳,制胶：溶液

28、配制（丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺、载体两性电解质等），灌胶； 电泳：加样可在凝胶上的任何位置，浓度一般为0.52mg/ml； 固定： 染色： 脱色：,80,81,二维电泳学习要点,理解：上述电泳原理和特点 应用：了解上述电泳技术的适用范围,82,二维电泳定义,二维电泳是同时利用分子的大小和等电点这两种特性的差别进行蛋白质等生物大分子的电泳分离方法。,83,二维电泳原理,在凝胶电泳槽的y方向上具有浓度分布，而在x方向上首先调配pH值梯度，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其等电点处。 然后将适当pH值的缓冲液渗透到凝胶中，在y方向上加电场使溶质再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及分子

29、量的影响，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，相互之间得到进一步分离。,二维电泳凝胶电泳等电点聚焦,84,二维电泳特点,分离度高，可分离等电点相差0.01个pH值的蛋白质； 处理量小，适用于分离微量的高纯度目标产物，用于科学研究；,85,86,87,逆向色谱电泳CACE结合了凝胶电泳的高分辨率和液相色谱的大处理能力，成为一种新型高效的蛋白质分离与纯化方法,9.5 逆向作用色谱电泳（自学）,88,在CACE过程中(图1)， I区凝胶颗粒内孔隙度小，蛋白质能渗入的体积小，为排阻区；11区凝胶颗粒内孔隙度大，蛋白质能渗入的体积大，为渗入区蛋白质随载液流过分离柱时， I区内流速大于区内流速调节直流电场强度，

30、使目标蛋白质逆向电泳速度介于两区流速之间， 目标蛋白质就在两区交界面处富集交界面处蛋白质浓度增加，导致平衡离子浓度增加，电导增加，电场强度下降，电泳速度下降，使目标蛋白质运动速度为零,结果加入分离柱内的目标蛋白质富集在交界面，并随加入量的增加向 区发展,9.5 逆向作用色谱电泳,89,9.5 逆向作用色谱电泳,90,CACE利用色谱速度的梯度变化实现溶质在电场中的聚焦，集色谱柱容量大和电泳 分辨率高的特点与于一体，可用于间歇和连续分离过程，具有很大应用潜力。为实现连续操作和满足在线检测的需要，在分离柱中设置不含凝胶的富集区，使目标蛋白质在此区域内连续富集,9.5 逆向作用色谱电泳,91,CAC

31、E不仅限于利用不同的凝胶过滤介质实现色谱速度的梯度变化，也可利用其他色谱介质（如离子交换、疏水作用等），或可利用其他作用力和方法实现溶质移动速度的梯度变化。例如梯度改变柱的直径可实现流动相流速即色谱速度的梯度变化；利用密度梯度可实现沉降速度的梯度变化；利用磁场替代电场看进行逆向足以色谱磁泳等。 CACE具有高分辨率、容量大的优点，但由于蛋白质的电泳迁移率较低，为提高电泳速度，必须在高电压下操作，产生的热量高。因此，为便于设备冷却，所用柱径很细，在一定程度上影响了CACE的分离能力。,9.5 逆向作用色谱电泳,92,9.6.1 分离装置 毛细管电泳和毛细管电色谱均利用毛细管 为电泳装置。 毛细管

32、电泳是基于电泳的差速分离方法； 毛细管电色谱是电渗流驱动的色谱分离方法，电泳在分离过程中也会发挥一定的作用。,9.6 毛细管电泳和电色谱,93,9.6.1 分离装置 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。,9.6 毛细管电泳和电色谱,94,毛细管材料主要有熔融石英、聚乙烯和聚四氟乙烯等。其中以石英毛细管的传热性最佳，应用最多。石英毛细管外壁涂有聚酰亚胺层，以提高毛细

33、管的弹性，防止脆裂。,9.6 毛细管电泳和电色谱,毛细管结构,毛细管是CE分离的心脏。理想的毛细管必须是电绝缘、紫外/可见光透明且富有弹性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。 毛细管内径一般为10100m，其截面结构图标意图如图17.23所示。,高效毛细管电泳仪high performance capillary electrophoresis apparatus,仪器,仪器流程与主要部件 process and main assembly,电压：030kV； 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-1910-21 mol/L）,高压电源,（1

34、）030 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换；,2. 毛细管柱 （1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差； （2）规格：内径2075m，外径350400m；长度=1m,100,紫外吸收,缓冲液池,化学惰性，机械稳定性好； 检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；,类型 检测限/mol 特点 紫外-可见 10-1310-15 加二极管阵列，光谱信息 荧光 10-1510-17 灵敏度高，样品需衍生 激光诱导荧光 10-1810

35、-20 灵敏度极高，样品需衍生 电导 10-1810-19 离子灵敏，需专用的装置；,102,9.6.2 分离原理 在电场中，毛细管内的电解质 因其荷电性质而发生电泳，同时在水溶液中，石英毛细管内表面的硅羟基解离而带负电荷，诱导管内产生电渗流。 电泳过程中，溶质的移动速度是电渗流和电泳的综合结果。,9.6 毛细管电泳和电色谱,电渗现象与电渗流 electroosmosis and electroosmotic flow,当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。,当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。,HPCE中的电渗现象与电渗流,石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,HPCE中电渗流的大小与方向,电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度E。即 电渗流