基本实验技术PPT参考课件

1、基本实验技术,1,2,2020/8/26,一 分子克隆,分子克隆指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合-重组DNA分子（重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达，即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。,3,2020/8/26,载体构建将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将重组质粒转入大肠杆菌，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而克隆基因或表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。,4,2020/8/26,慢病毒载体（Lentiviral vec

2、tor, LVs）是在 HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或 RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。,慢病毒稳定细胞株构建,5,2020/8/26,转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。可通过转染干扰片段或过表达质粒，研究基因的作用。,siRNA转染在一周内有效，需要马上进行功能实验。但转染效率受细胞类型及细胞状态影响，对于难以转染的细胞，建议用慢病毒构建稳定细胞株再进行后续实验，比如神经元细胞、干细胞。,6,2020/8/26,实时定量 PCR (Real - Time Quantitative Polymerase ChainReaction) 是

3、在经典 PCR技术基础上，通过在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用特定仪器检测荧光信号积累的强弱，进而实时监测每一轮 PCR 反应产物，并对与其产物量呈正相关的初始模板进行定量分析的技术。,二 基因表达与调控,7,2020/8/26, 绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究,8,2020/8/26,9,2020/8/26,染色质免疫共沉淀（Chromtin Immuno Precipitation， CH

4、IP）是目前唯一研究体内 DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。,研究DNA 甲基化 检测已知蛋白的靶基因 组蛋白修饰 染色质结构 转录因子的协同结合,10,2020/8/26,CHIP实验技术流程图,11,2020/8/26,蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗

5、体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。 该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。,三 蛋白表达与功能分析,12,2020/8/26,13,2020/8/26,四 病理实验,免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），进行定位及相对定量研究的一种技术。能将目地抗原的表位及表达量直观的呈现出来 。,免疫荧光(Immunofluorescence，IF)是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗

6、原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。可以采用不同激发波长的荧光二抗标记不同的目的蛋白，同时观察两种蛋白的表达及共定位情况。,14,2020/8/26,TUNEL细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组 DNA断裂时，暴露的 3-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的 dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。是分子生物学与细胞形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确反映细胞凋亡的形态特征。,原位杂交（ISH）基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射

7、性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。可确定组织中目的核酸的表达位置和表达量。,15,2020/8/26,IHC,IF,TUNEL,16,2020/8/26,五 细胞功能实验,细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。可用于研究与细胞增殖相关基因及细胞毒性实验等。,细胞增殖检测,MTS原理为淡黄色的物质被细胞生物还原为一种可溶性的有色产物，利用分光光度计检测490nm处吸光值来反应细胞的增殖与细

8、胞活性。颜色越深，OD值越大，细胞相对数量越多，细胞相对活力越高。,区别： MTS检测相对细胞数量与相对细胞活力（OD值与细胞数量间为对数关系且与细胞活力共同影响OD值）。 生长曲线检测绝对细胞数量，及死活，但对细胞活性如何无法得知。,17,2020/8/26,细胞生长曲线,MTS,18,2020/8/26,细胞迁移能力检测,细胞划痕愈合实验是测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，

9、以此判断细胞的生长迁移能力。,Transwell 迁移实验在 Transwell 小室上室种细胞，下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子，细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。,划痕愈合实验比较细胞的侧向运动能力，Transwell迁移实验比较细胞纵向运动及变形能力。,19,2020/8/26,Transwell小室,20,2020/8/26,细胞划痕愈合,Transwell迁移,21,2020/8/26,细胞侵袭能力检测,Transwell 侵袭实验，与Transwell迁移实验不同的是，侵袭实验上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先

10、要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。主要模拟细胞分泌金属蛋白酶消化细胞外基质。侵袭实验比较细胞分泌基质金属蛋白酶，破坏细胞外基质并向其他组织转移的能力。,Transwell侵袭,22,2020/8/26,六 流式细胞术,流式细胞术（flow cytometry, FCM）一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。,流式检测细胞周期 PI，即碘化丙锭，可以与细胞内 DNA 和 RNA 结合，采用 RNA 抑制剂将RNA 消化后，通过流式细胞术检测到的与 DNA 结合的 PI 的荧光强度直接反映了细胞内 D

11、NA 含量的多少。由于细胞周期各时相的 DNA 含量不同，通常正常细胞 G1/G0 期具有二倍体细胞的 DNA 含量(2N)，而 G2/M 期具有四倍体细胞的 DNA 含量(4N)，而 S 期的 DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内 DNA含量进行检测时，可以了解不同细胞周期各细胞亚群比例。由于晚期凋亡细胞 DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。,23,2020/8/26,流式检测细胞凋亡 Annexin VPI双染法，在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征， Annexin V是一种分子量为 3536kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸检测凋亡