无菌检验及控制-王旭.ppt

1、无菌检验及控制,王旭 2009,教程目的,GMP检查中常见的缺陷 无菌检验的局限性 无菌检验样品的取样控制 无菌检验用培养基及其灵敏度检查 无菌检查方法和验证 无菌检验过程中的污染控制 无菌检验阳性结果的调查,1 GMP检查中常见的缺陷,未建立XXX注射液无菌检查的检验操作规程，现企业出示的无菌检验规程仅抄录中国药典附录“无菌检查”的内容。 XXX注射液检验标准操作规程中无菌检查项目无具体操作程序。 冻干粉针剂产品的无菌试验方法验证不符合2005年版中国药典的要求。 配制后的培养基未按规定的条件灭菌并进行灵敏度试验。,1 GMP检查中常见的缺陷,检定用菌种的传代记录过于简单，无代次内容。 对检

2、定菌的管理不完善，未对检定菌的使用情况进行记录。阳性菌的菌种传代记录内容不完整，未登记购入菌种的编号。 无菌检查记录不及时，不完整，对该企业检验室进行现场检查时，正在进行无菌检查培养的批次产品的无菌检查记录尚未填写，仅登记了无菌检查工作台帐， 2006年8月30日进行无菌检查在无菌检查工作台帐有登记的XXX批XXX产品，在33度孵化室内未发现有相应的集菌器，且无任何异常情况记录。,1 GMP检查中常见的缺陷,无菌检验不合格后进行复试无相应文件规定，且复试前的分析评估内容简单。 微生物培养室内培养箱的温度未如实记录，如现场检查时02号培养箱显示箱内温度为26.5度，该培养箱温度记录从2006年1

3、月1日至8月8日记录的温度均为24.6度。,2. 何为无菌,理论上: 无菌 = 完全没有生命,而实际上: 我们无法证明产品中没有活微生物存在 无法对整批进行100%检验 无菌检验的结果只是一个基于“可能性”的判断 无菌检验用培养基有其局限性 只进行细菌和真菌的检验 对实验结果的判定是基于“是否在培养基中生长” 我们的工作环境及操作是在相对无菌的状态,3. 无菌检验 _ 取样计划,我们期望什么? 在整批产品中无微生物存在 我们做的是什么测试? 无菌检验是一个破坏性的实验 我们不能对整批进行100%检验 如何通过无菌检验来证明整批产品无菌？ 要求有一个取样计划来涵盖整个批号 有足够的取样量和检验量

4、,什么是批? 在同一条件下制备出的密封容器的集合（具有同质性），其每个单位容器被污染的几率是一样的。 如何对批进行取样？ 用于无菌检验的样品必须具有批代表性，但尤其要考虑从最易污染的位置取样（摘自英国药典）,3. 无菌检验 _ 取样计划,何时取? 如何取? 无菌灌装产品： 批开始、结束及重大故障和调整后。 最多24小时为一批 USP . 每天灌装的产品应分别做无菌检验. 最终灭菌产品： 从灭菌柜中最冷点取样。 对经不同灭菌柜灭菌的产品应分别进行无菌检验。 连续工艺： 产品被连续地单个灭菌，如：用电子束灭菌，一批不大于24小时。,3. 无菌检验 _ 取样计划,取多少样 （检验数量）? 药典上规定

5、每次无菌检验的最少取样数量 取决于批量，如：中国药典2005版 ，注射剂： 大于500：取2% 或20支（取少），用于每个培养基检验 小于等于100：取10%或4个（取多），用于每个培养基检验 取决于剂量. 如：中国药典2005版 ，剂量小于1毫升，就要取40支 同时要考虑检验损耗和复试,3. 无菌检验 _ 取样计划,每个样品测多少? （检验量） 药典上规定了每次检验的供试品总量，如：中国药典2005版 装量小于 1 ml：每支样接入每个培养基为全量 装量大于等于 1 ml. EP: 半量，但不超过20 ml. CP: 半量， 2 to 500 ml USP: ,3. 无菌检验 _ 取样计划,

6、取样的局限性 相对于整个批量而言，取样的数量是十分有限的，如： 若在有1%产品污染的批号中取20个样品进行检验，80%的可能无菌检验通过。 若在有5%产品污染的批号中取20个样品进行检验，30%的可能无菌检验通过。 无菌检验通过的可能性是基于整批产品的受污染程度。,3. 无菌检验 _ 取样计划,美国非肠道药物学会注射剂无菌测试结果,试验目的：不合格的可能性(%) 试验批量：60,000支 试验方法：按美国药典无菌测试方法,取样的局限性 （续） 检验数量多少影响检验通过与否。 检验量的降低会使检出率降低。 无菌检验只能给出该批产品使污染的程度。 无菌检验通过只能说明被测样品无菌，不能证明整批无菌

7、。,3. 无菌检验 _ 取样计划,结论: 要有一个完整的取样计划涵盖整个批生产过程，并要考虑到“最坏情况”以提高检出可能性。 检验数量和检验量应满足药典要求。,3. 无菌检验 _ 取样计划,我们期望什么? 在整批产品中无微生物存在 我们做的是什么测试? 无菌检验是通过目检微生物在培养基中的生长来判断结果 如何通过无菌检验来证明整批产品无菌？ 能支持微生物生长并无菌_ 培养基的灵敏度检查 培养基的保存控制 无抑制微生物生长的因素存在_ 方法验证试验,4. 无菌检验 _ 培养基,4. 无菌检验 _ 培养基,检验用培养基 两种微生物培养基： 用于真菌培养的改良马丁培养基，培养温度：23-28。 用于

8、厌氧和需氧细菌培养的硫乙醇酸盐流体培养基，培养温度：30-35。,4. 无菌检验 _ 培养基,培养基的灵敏度检查 所有培养基必须无菌 从每批培养基中随机取样，培养14天：中国药典5瓶；美国药典10%或20瓶（取少）。 按药典要求所列的菌种表，证明培养基灵敏度。 接种 10-100 cfu 需氧菌- 金葡、铜绿和枯草- 至FT 30 35培养 3天 接种 10-100cfu 厌氧菌- 生孢梭菌- 至 FT 30 35培养3天 接种 10-100cfu 真菌- 白念、黑曲霉 至 UM 23 28培养 5天 要求从生产环境中分离出的典型菌株 在培养基中生长良好 所用菌株传代次数小于等于5代,4. 无

9、菌检验 _ 培养基,培养基保存控制 应规定保存有效期: 在密闭容器中一年，并在灵敏度检查后3月内使用 防氧化 选择长宽比例恰当的容器，以减少与空气的接触面 2-25保存 确保pH 在密闭容器中保存,4. 无菌检验 _ 培养基,无菌检验用培养基的局限性； 药典规定的培养基所能支持生长的微生物是有限的。 微生物包括：原生生物、细菌、真菌、支原体和病毒等。 这些微生物有广泛的生长要求，如：营养、温度、氧等 无菌检验培养基不可能支持所有微生物的生长，它们只是针对于那些最有可能污染药品和在药品中生长的微生物。,结论: 在无菌检验中使用两种微生物培养基 每批灭菌后都应进行灵敏度检查 有效控制微生物培养基的

10、保存和效期 方法验证证明在当前实验条件下，对产品的无菌检验没有抑菌因素的干扰,4. 无菌检验 _ 培养基,5. 无菌检验 _ 方法,药典规定两种方法: 直接接种法: 样品直接移入无菌培养基中 薄膜过滤法 _ 80% 产品用0.45m膜过滤并用3x 100ml无菌蛋白胨水淋洗后加入培养基。膜的选择应保证膜在使用前后的完整性。 替代方法: 生物指示剂替代法：以菌片替代产品进行无菌检查 （一般只用于器械）菌片放置位置需要验证,直接接种法 用于不能过滤的样品 若样品本身的混浊，可能要求再培养- 延长了检验周期 样品的检验量有限制， 接种体积不能大于培养基体积的10%，因此就要求更多的培养基 可能要考虑

11、对样品中抑菌因素进行中和 易污染 由于该方法是敞开式的 应培养基管数与检验数量一致，则提高了所用培养基容器数量,5. 无菌检验 _ 方法,薄膜过滤法 不适用于无法溶解的样品，如无菌衣或肠线 大体积检验量，不存在稀释培养基问题 样品中的抑菌因素可被滤除 中和试剂可应用在淋洗液中，如：-内酰胺酶 分散剂可作为溶剂，如十四烷酸异丙酯 不必再培养，因此检验周期确定 大样品检验量不必增加培养基。 可以是封闭系统，如 STERITEST，降低污染可能性 培养基较清澈，易观察生长情况,5. 无菌检验 _ 方法,5. 无菌检验 _ 方法,两种方法的共同点: - 培养基和培养温度 - 培养时间 - 工作环境：1

12、00级区域或隔离系统中进行,5. 无菌检验 _ 方法,方法验证试验 _ 证明在试验条件下没有抑菌作用，如：防腐剂，抗生素 完全按照常规检验方法进行，除进行下列改变： 在产品中加入与培养基灵敏度检查相同的需氧、厌氧和真菌菌株（ 10-100cfu），进行常规检验。 在要求的温度下培养3-5天，生长良好。 下列情况应进行重新验证： 检验方法变更 培养基变更 产品处方变更,5. 无菌检验 _ 方法验证,结果判断： 培养结束后，目测培养基是否浑浊 无微生物生长表示检验通过 有微生物生长表示供试品不合格 对不合格结果应进行调查,5. 无菌检验 _ 方法,结论: 有两种检验方法，但所用培养基、培养温度、时

13、间相同 过滤膜应淋洗至少3次，但总淋洗体积不能超过1000ml 培养期间应逐日观察并记录是否有生长,5. 无菌检验 _ 方法,6. 无菌检验 _ 污染控制,药典标准使作出“检验结果无效”的判断十分困难 除非有充足的证据证明无菌检验是在实验室被污染 所以实验室污染控制就十分重要，以避免由于检验事故造成整批产品报废,无菌检验用实验室 中国药典2005 要求, 无菌检验应在无菌环境下进行（100级或隔离系统） 其洁净和微生物要求与无菌生产厂房一致 其控制要求与生产区域一致，如：空调、更衣、清洁、缓冲_ 定期验证 应有环境监控程序并根据实际情况设定行动线,6. 无菌检验 _ 污染控制,6. 无菌检验

14、_ 污染控制,样品 在样品进入无菌区前应进行消毒处理 在进行样品外表面消毒时，应确保样品的完整性 考虑所用消毒液渗透过样品容器的可能性，如：透过塑料容器,6. 无菌检验 _ 污染控制,设备与培养基 所有与无菌测试接触的设备和培养基都必须无菌 所有进入无菌检验区域的设备要灭菌或消毒 每批培养基都应在使用前或与无菌检验平行进行无菌和灵敏度测试 所有培养基在使用前应检查，无浑浊和颗粒 使用封闭的无菌检验系统，如 steritest 使用隔离技术，如隔离系统; 尽量自动化,6. 无菌检验 _ 污染控制,阴性对照： 不加样品的无菌检验 与无菌检验同时做 对操作者，设备和培养基控制 若使用隔离系统则可能不

15、必 阳性对照 对操作进行控制，避免无菌操作中的抑菌作用,6. 无菌检验 _ 污染控制,7 无菌检验 _ 阳性结果的调查,药典标准使作出“检验结果无效”的判断十分困难, 如 CP2005 and USP 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法要求 回顾无菌测试过程，发现有可能引起微生物污染的因素 阴性对照有菌生长 供试品中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的,7. 无菌检验 _ 阳性结果的调查,无菌测试的阳性结果 鉴定 + 重复阴性对照试验,调查测试的有效性,重复测 试结果,复测,QA,用分离菌进行阳性对 照测试,试验有效,试验无

16、效,合格,不合格,合格,不合格,支持生长,不支持生长,停止实验室调查产品不合格,实验室调查：一个合适的调查程序和记录是必要的,结束了吗？,停止实验室调查产品不合格,产品检测合格,若产品不合格，必须通过该批生产过程回顾找出污染原因和污染源 人 物料 环境 设备 方法和工艺 所有无菌检验失败和产品不合格数据应保留记录并归纳在一个分类表中，进行定期回顾和分析 偏差处理和定期生产回顾,7. 无菌检验 _ 阳性结果的调查,灭菌柜灭菌参数记录 培养基、设备准备使用记录 培养基灵敏度测试记录 培养箱温度记录 设备物料记录无菌室的记录 设备校验维护记录,隔离系统灭菌记录 清洁记录 测试数据 环境监控记录 趋势分析 无菌检验失败调查记录,为便于调查而要求的文件,所有与检验相关的可追溯性文件都必须保留,7. 无菌检验 _ 阳性结果的调查,结论: 在根本原因找出前，千万不能随意丢弃无菌检验结果 注意：没有记录就表示没有做 所有无菌检验结果和调查数据应保存并规类进行趋势分行,7. 无菌检验 _ 阳性结果的调查,8. 无菌检验