基因型鉴定心得.pptx

1、培训心得之基因型鉴定,刘艺,基因型鉴定基本步骤,DNA提取 PCR反应,DNA提取,所取样本鼠尾 取样时间 取样过程 动物标记 取样记录 注意事项,取样时间 10d-14d 鼠小，尾尖部DNA充足，出血少，毛少，易操作。,取样过程 器械：眼科剪，小镊子，酒精棉，基因型检测记录表，记号笔，1.5ml EP管（消毒） 减尾长度：1cm左右 小贴士：双人操作，一剪一消毒，两剪同时进行，三序核对，稳准狠,R,F,脚标：剪鼠尾的同时，剪去一小段不同脚趾，通过不同脚趾的缺失排布以确定该小鼠的编号。 前肢用字母F（front leg）表示(1-8)， 后肢用字母R（rear leg）表示(1-10)。 思考

2、：第26只小鼠标记是什么？,动物基因型检测记录表,检测鼠ID,样品准备的注意事项 鼠尾最好当天剪完当天进行DNA的提取。 如不能提应放至-20冰箱保存，但注意冻存时间不宜过长。 低温保存的样品不宜反复冻融。,举例：百奥赛图老师们10d剪尾1周做检测18d基因型鉴定完毕分笼,DNA提取的总流程,标注序号 裂解液的 配制 鼠尾裂解,离心去杂质 吸取上层 溶液 异丙醇沉淀,离心洗涤 室温风干 水溶DNA,裂解液的配方 蛋白酶K（PK）：储存浓度：10mg/ml；终浓度100ug/m; -20保存。 储存液可以事先配制好，蛋白酶K要现用现配。 配制列子：10ml裂解液 Tris-HCl 1ml EDT

3、A 100ul NaCl 667ul SDS 200ul 蛋白酶K 100ul 10000ul(10ml)-1967ul=8033ul水,提取具体步骤,PCR鉴定,引物设计 条件摸索 常见问题 举例说明,引物设计,设计原则 引物长度一般为2024bp 引物碱基尽可能随机分布：GC含量约60% 引物不应有发夹结构：即不能有4bp以上的回文序列 引物的3端为关键碱基：两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列 在3端不应有任何互补碱基 产物大小：约200300bp Tm值：60左右 特异性：即无目的条带之外的多余条带 最理想的鉴定引物，一对引物即可以区分两种基因型,条件摸索,DNA模板 引物

4、 Mg2+浓度 dNTP Mixture ddH2O 退火温度 温度梯度下如果没有条带，直接换引物吧！,常见问题,引物是关键： 无扩增产物引物设计不当或发生降解 非特异性扩增引物特异性差,原因,对策,重新设计引物吧！,模板要干净，浓度要合适 无扩增产物：含量低，含有抑制物（酒精没洗干净） 非特异性扩增：模板浓度过高 拖尾现象：模板不纯 模板在加入MIX之前要测定浓度 OD:260/280 纯DNA浓度OD值大约在1.8,假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物（水对照，阴性对照）。,原因,被污染了！,1.操作时动作要轻柔 2.器材要高温高压消毒 3.各种试剂事先分装，低温贮存,PCR中对照组的设

5、立,Cre-loxp system Flp-Frt system 基因敲进Rosa 26 工具鼠查找使用,Cre 一种重组酶，可由噬菌体转染到细胞，催化Loxp位点间的DNA进行特异性重组。 Loxp 34bp序列，两端是13bp的反向重复序列，中间是其定向作用的8bp间隔区。 重组产物 根据loxp位点的位置和相对方向而不同，在一条链上单loxp位点的DNA将被融合。,Cre,Loxp,Loxp,Flp-Frt system:主要用来去除Neo,Neo,Frt,Frt,Flp,Neo：新霉素抗性基因(neo)是真核表达载体的常用筛选标志。,基因敲进Rosa 26 Rosa 26不编码蛋白质，

6、在其前面加入强启动子，后面加一个过表达的基因便可以实现定点敲进，用于识踪。,Target,Neo,Neo 后有一个stop序列，所以当Neo存在时，后方的报告基因不表达，Cre敲掉目的基因同时报告基因被敲进。,Loxp,Loxp,Promotor+Rosa26+gene,Frt,Frt,Cre,工具鼠 含有重组酶（Cre,Flp)的小鼠，可与含（Loxp,Frt)小鼠交配，得到基因敲除/敲进小鼠。 选择工具鼠： 有详细的介绍各种工具鼠。 工具鼠是B6品系的。 Promotor 全身性敲除，特异性敲除，常染色体，性染 色体。 工具鼠的纯和程度，概率。,Target,Neo

7、,Loxp,Frt,Frt,Loxp,全基因敲除,Cre,PCR过程中各种对照组的选择,获得全基因敲除/敲进小鼠 F1代杂合子小鼠(fl-neo) 直接跟Cre-deleter小鼠交配，从而将exon6和Neo cassette 一起敲除，获得全基因敲除目的基因同时敲进Tdtomato报告基因的小鼠。 杂合子小鼠交配获得纯合子。,1. 与Cre-deleter小鼠交配，获得全基因敲除/敲进杂合子小鼠,Controls: +/+, Cre/+,2. 获得全基因敲除/敲进纯合子小鼠,Controls: M / +; + / +,获得条件性基因敲除/敲进小鼠, 由于Neo cassette位于目的基

8、因的下游，不会影响目的基因的表达，但Neo cassette的存在势必会一定程度上影响小鼠的表型。所以得到F1代杂合子小鼠后，需要去掉Neo cassette。Neo cassette的两端分别有一个Frt序列，是Flp重组酶的识别位点。将杂合子小鼠(fl-neo)与Flp-deleter小 鼠交配，得到带有Flp转基因的floxed（fl）杂合子小鼠。 fl杂合子小鼠再与组织特异性的cre小鼠交配，实现Dmp1基因组织特异性,与Flp-deleter小鼠交配，去除 Neo cassette,基因型为 fl/+,Flp/+，表明已去除掉Neo cassette ，小鼠将用于下一步交配； 所用的Flp-deleter小鼠可以是纯合子，也可以是杂合子。,与组织特异性Cre小鼠（ts-Cre）交配，获得fl杂合子小鼠。,1. 此步只能获得杂合子，纯合子小鼠