EPO的杂质检测方法

1、1,EPO的杂质检测方法,2005级生命科学基地班 张毅荣 王 薇,2,EPO中的杂质检查项,外源性DNA CHO细胞蛋白 牛血清白蛋白 钠离子 枸橼酸离子 细菌内毒素 异常毒性实验 可见异物检查,3,一.外源性DNA残留量测定法 斑点杂交法,原理： 供试品中的外源DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA。将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA比对后，可测定供试品中外源DNA的含量。,4,试剂： DNA标记和检测试剂盒 DNA杂交膜 尼龙膜或

2、硝酸纤维素膜 2%蛋白酶K溶液 称取蛋白酶K0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20 备用。 3%牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白0.03g，溶于灭菌水10ml中。 1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0） 用盐酸调pH值至8.0 5.0mol/L氯化钠溶液0. 0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）. 5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）。,5,20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液 用盐酸调pH至7.2。 蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液1.0ml(pH8.0),5mol/L氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L E

3、DTA溶液（pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5ml, 加灭菌水至10ml。 TE缓冲液（pH8.0) 量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml,0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2ml, 加灭菌水 至1000ml。 1%鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA0.01g,置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于 -20 备用。 DNA稀释液 取1%鱼精DNA溶液50l，加TE缓冲液至10ml。,6,用于探针标记和阳性对照的DNA, 由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴

4、定可参考下述推荐方案进行。,探针标记和阳性对照的DNA的制备,7,将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每lml含 107个细胞。取悬液lml，离心，在沉淀中加裂解液400 l 混匀，37作用12-24小时后，加入饱和酚溶液450l , 剧烈混合，以每分钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450 l 重复抽提一次; 转移上层液体，加入三氯甲烷450 l ，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟; 转移上层液体，加入pH5.2的3mol/L醋酸钠溶液40 l ，充分混合，再加入-20以下的无水乙醇1ml ,充分混合，-20以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟;

5、用适量-2070%乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，酚/三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA, 即得。,8,鉴定阳性对照品的DNA纯度: 10%琼脂糖凝胶电泳法:无RNA和寡核昔酸存在; 分光光度法:A260 /A 280 比值应在1.8-2.0之间。,用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声波处理，使其片断大小适合于DNA杂交和探针标记。 探针的标记 按试剂盒使用说明书进行。,9,测定法斑点杂交法 (1)蛋白酶K预处理 按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加样，混合后37保温4小时以上，以保

6、证酶切反应完全。,10,注意事项: 1） Dl、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每1ml中含DNA1000ng。然后依次10倍稀释成10ng/100l (D1)、1ng/100 l (D2) 、100pg/100l (D3)三个稀释度; 如成品使用剂量较大，而且 DNA限量要求（100pg/剂量）较严格时，则需要提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA对照应稀释成100pg/100l (D1)、10pg/100 l (D2) 、1pg/100l (D3)三个稀释度。阴性对照为DNA稀释液。,11,2） 用DNA稀释液将供试品(原液)稀释至每100l含1人份剂量。 3） 加入

7、3%牛血清白蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质与供试品(通常为蛋白质)的酶切条件保持一致;如供试品为其他物质，则应改用其他相应物质。,12,(2)点膜 用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照置100水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却，以每分钟8000转离心5秒，用抽滤加样器点样于杂交膜(因有蛋白质沉淀，故要视沉淀多少确定加样量，以避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阴性对照加样体积应一致，或按同样比例加样)。晾干后置80真空干烤1小时以上。,13,（3）杂交及显色 按试剂盒使用说明书进行。 将膜置于预杂交液中(5* SSC, Blockingr

8、eagent 1%w/v, N-lauroylsarcosine sodium salt0.1%w/v, SDS 0. 02 % w/v) 68预杂交4h,置膜于含25ng/ml探针的杂交液中，68杂交16h。 为了降低杂交膜背景，膜片的洗涤用2*SSC,0.1%SDS室温洗2次，15min/次，后用0.1*SSC,0 .1 % SDS洗二次，每次15min，不断振摇后将膜置于l0ml Buffer I (0. lmol/L Tris-HCl pH7. 5 0.15mol/L NaCI)中，静置1min，再将膜置于Buffer (Buffer I加入1 % Blocking reagent)中

9、30min，再置于含150mU/ml Anti-digoxigenin-AP conjugate的Buffer中37 40min。待反应完毕后，用BufferI洗膜2次，15min/次，用Buffer (100mmo1/L Tris-HCl pH9. 5，100mmo1/L NaCI, 50mmo1/LMgCl2)平衡5min后，取l0ml Buffer加人400l 显色液浸匀，将膜片置于其中，暗处显色。当斑点清晰后，用注射用水洗膜，室温晾干。,14,结果判定 阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定的颜色梯度，阴性对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照D3，试验成立。将供试品

10、与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。,15,16,二.双抗体夹心法测杂蛋白含量 检测原理：,将已知抗体包被微量反应板和待测抗原发生特异性免疫反应，再加酶标抗体和底物，根据显色反应对抗原进行定性或定量。,17,18,1.抗BSA单抗的制备及筛选 用BSA免疫BALB/c小鼠，共3次，每次间隔2-3周。取脾，SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选阳性克隆，检测单抗亚型。大量制备并纯化单抗。,2抗BSA多克隆抗体的制备及标记 用BSA免疫白兔3次，每次间隔1周，采血，硫酸铵沉淀及层析纯化，蛋白定量，采用过碘酸钠一乙二醇方法标记辣根过氧化物酶(HRP)。,19,3. EL1SA夹

11、心法 将定量后的单抗稀释到1:400后包被96孔酶标板，4包被过夜，37封闭1h。分别加入0-40 ng/ml浓度BSA的标准溶液，每浓度2孔，100 l /孔。以稀释液作为空白对照。待测样品分别测定原倍和2倍稀释后浓度。37孵育1 h,PBST-Tween 20洗涤。加入1:12 000稀释度的酶标抗BSA多克隆抗体，100 l /孔，室温30 min。PBST-Tween 20洗涤。加入TMB显色，100l /孔，室温10 min。加入1 mol/LHCl终止。测定A450，以0 ng/ml标准溶液的A值消零。以BSA含量为横坐标，A值(两孔均值)为纵坐标，绘制标准曲线。应为一直线相关。,

12、20,21,三.钠离子测定法,本法系用火焰光度法测定供试品中钠离子含量。某些含碱金属或碱土金属元素的供试品溶液用喷雾装置以气溶胶形式引入火焰光源中，靠火焰的热能将供试品元素原子化并激发出它们的特征光谱 ，通过光电检测系统测量出待测元素特征光谱的发光强度可求出供试品中待测元素的含量。通常借比较对照品溶液和供试品溶液的发光强度，求得供试品中待侧元素的含量。,22,测定法 精密量取供试品0.5ml,置50ml量瓶中,用水稀释至刻度，即为供试品溶液。按火焰光度法测定，在589nm波长处测定供试品溶液的发光强度。另精密称取于110干燥至恒重的氯化钠0.293g,置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，再精密

13、量取该溶液0.9ml、1.1ml、1.3ml、1.5ml、1.7ml，分别置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，制成0. 9mmol/L、1. 1mmol/L、1.3mmol/L、1.5 mmol/L、1.7mmol/L的系列标准钠溶液，同法操作。 用系列标准钠溶液的浓度对其相应的发光强度作直线回归处理，将供试品溶液发光强度代入回归方程，求得供试品溶液钠离子浓度为(mmol/L),，再乘以供试品的稀释倍数(100),计算出供试品钠离子含量。,23,四.枸橼酸离子测定法,高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在

14、柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。 应用HPLC对样品进行分离分析，主要根据样品的性质选择分离类型及相应的色谱柱，流动相，检测器等。,24,色谱条件 用苯乙烯二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色潜柱(H+)，粒度9m或8m, 内径7.8mm, 柱长300mm; 柱温为50; 流动相为0.004mol/L硫酸溶液，流速为每分钟0.8ml，示差折光检测器。,25,测定法 精密称取经减压干燥至恒重的枸椽酸钠0.735g，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，精密量取5.0ml、10.0ml、15.0ml，分别置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀, 即得相

15、对应的5.0mmol/L、10.0mmol/L、15.0mmol/L枸檬酸离子对照品溶液。分别精密量取20l，注入液相色谱仪，记录色谱图; 另精密量取供试品溶液1 ml,置15 ml离心管中，精密加1.5%磺基水杨酸溶液lml ,混匀。室温下以每分钟2000转离心10分钟。取上清液，同法测定。 用对照品溶液的枸橼酸离子浓度对峰面积进行直线回归，求得回归方程，计算出供试品溶液枸橼酸钠含量(mmol/L)，再乘以供试品稀释倍数，计算出供试品枸橼酸离子含量(mmol/L).,26,五.细菌内毒素检查法,鉴于家兔法费时较长，操作繁琐，近年来发展了体外热原试验法即鲎试验法，其原理是利用鲎(Limus p

16、olyphemus)的变形细胞溶解物(amebecyte lysate)与内毒素之间的凝集反应来检测或定量内毒素。 通过凝胶限量试验来检测由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。,27,鲎试验检测细菌内毒素的机理,28,凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0. 015EU/ml的灭菌注射用水。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和一与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污

17、染。,29,供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0-8.0的范围内。 对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。,30,内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定: L=K/M 式中L，为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示; K为人每公斤体重每小时最大可接受

18、的内毒素剂量。以EU/(kgh)表示，注射剂K=5EU/(kgh)，放射性药品注射剂K=2.5EU /(kgh)， 鞘内用注射剂K=0.2EU /(kgh); M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml /(kgh)、mg/(kgh)或U /(kgh)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。,31,确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD: MVD=cL/ 式中L为供试品的细菌内毒素限值; c为供试品溶液的浓度，如供试为注射用无菌粉末或原料药

19、，则MVD取1,计算供试品的最小有效稀释浓度c=/L; 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。,32,鲎试剂灵敏度复核试验,根据鲎试剂灵敏度的标示值（）将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2、0.5和0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒。取分装有0. 1ml鲎试剂溶液的10* 75mm试管或复溶后的0. 1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18支，其中16管分别加入0.1ml 不同浓度的内毒素标准溶液， 每一个内毒素浓度平行做4管; 另外2管加0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试

20、管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37士1的恒温器 中，保温60分钟士2分钟。,33,34,将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度若管内形成凝胶，且不变形、不从管壁滑脱者为阳性;未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。,35,当最大浓度2管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(c)。 c=lg-1(X/4) 式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个是阳性结果的浓度。 当c在0.5-2(

21、包括0.5和2)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。,36,抑制性干扰试验 适用情况： 1.进行新药的内毒素检查试验前 2.无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时 3.当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺 改变或 试验环境中发生了任何有可能影响试验结果 的变化时，须重新进行干扰试验,37,按下表制备溶液A、B、C和D，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。,38,按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。,Et =lg-1(Xt/4),Es

22、 =lg-1(Xs/4),Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值。 当Es在0.5-2(包括0.5和2)及Et在0.5Es-2Es (包括0.5Es和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。,39,检查法 凝胶限量试验 按下表制备溶液A,B,C和D。使用稀释倍数为最大有效稀释倍数并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 凝胶限量试验溶液的制备 注: A为供试品溶液, B为供试品阳性对照，C为阳性对照，D为阴性对照。,40,结果判断 保温60分钟+2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，

23、阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。 若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定;若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定;否则判供试品不符合规定。,41,六.异常毒性检查法,本法系生物制品的非特异性毒性的通用安全验检查制品中是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。,原理：用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种试验动物，观察其毒性反应。反应的判断以试验动物的死亡与否为终点。,42,检查法 - 小鼠试验法 除另有规

24、定外，每批供试品用5只小鼠，注射前每只小鼠称体重，应为18-22g。每只小鼠腹腔注射供试品0.5ml,观察7天。观察期内,小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，供试品判为合格。如不符合上述要求，可用10只小鼠复试一次，判定标准同前。,43,七.可见异物检查法(灯检法),可见异物是指存在于注射剂中，在规定条件下目视可以观测到的任何不溶性物质。 实验室检测时应避免引入可见异物。当复溶冻干制剂时，或盛装供试品的容器(如不透明、不规则形状容器等)不适于检测，需转移至洁净透明的适宜容器中时，均应在l00级洁净环境(如层流净化台)中进行。,44,图中A为带有遮光板的日光灯光源。光照度可在

25、1000-3000lx范围内调节。用于无色溶液检查，光照度应为l000-1500lx;用于透明塑料容器或有色溶液检查，光照度应为2000-3000lx。B为不反光的黑色背景。C为不反光的白色背景和底部(供检查有色异物)。D为反光的自色背景(指遮光板内侧)。,45,检查法 除另有规定外，取供试品，除去容器标签，擦净安瓶外壁污痕，放室温静置一定时间,在避光室内或暗处，手持瓶颈部于伞棚边缘处,在明视距离(指供试品至人眼的距离，通常为25cm)，分别在黑色和白色背景下,轻轻旋转和翻转容器使药液中可能存在的可见异物悬浮(注意不使药液产生气泡)，用目检视。检查时限为20秒。供试品装量每支(瓶)在10ml以

26、下的每次检查拿取2支(瓶);10ml以上的每次检查拿取1瓶(支)。50ml或50ml以上注射液按直、横、倒三步法旋转检视。,46,(1) 注射液 除另有规定外，取供试品20支(瓶)，照上述方法检查，检出可见异物的应不得超过1支(瓶)。如检出可见异物的有2支(瓶)，应另取20支(瓶) 同法复试，均不得检出玻璃屑、纤维、色点、色块及其他外来异物。,(2）注射用冻干制剂 除另有规定外，取供试品5支(瓶)。将供试品和溶解液的温度平衡至各品种规定的溶解温度，再沿瓶壁缓缓注入溶解液，旋转轻摇溶解。有真空的供试品，待供试品即将全部溶解时，破其真空，照上述方法检查; 无真空度的供试品，待供试品全部溶解后照上述

27、方法检查，应不得检出可见异物。如检出可见异物的有1支(瓶)，应另取5支(瓶)同法复试，均不得检出玻璃屑、纤维、色点、色块及其他外来异物。,47,参考文献 1.中国药典2005年第三部 2.周铁群，陈震，强东.应用酶免疫方法检测生物制品中残余牛血清白蛋白含量.中国生物制品学杂志, 2004,17(3):171-172. 3.孟胜利.对疫苗DNA残留的检测.生物技术世界,2006,06:44-45 4.李玉，姚伟，张岩锐，王跃.地高辛标记探针检测生物制品中残余DNA含量.微生物学免疫学进展. 2002, 30(4):23-255. 5.黄冬,房判石,金燕辛.鲎试剂法检测细菌内毒素假阳性原因浅析.首

28、都医药.2002,05:53-54 6.张新妹.细菌内毒素检查法:指导原则.中国药品标准2004,5(2):58-61,48,谢谢,膍屾壎馕挬剷琳揤熒宄球禙圎鵉边皜磪匕赛噅濁端嚺鵳猚蟌兺嶐鷘鐧蓮晆飉碊瞤籢亀躼柱磟懻齾嵤蝦縯糥锶葈飅役櫧換彦拑薸岈冪栽凩舎扇彻圁甜隇到紤淴玒菓傴熒樃彠伿進眗塋樖铭牻巄蜣洓炋鷡狠剀閩獛訄斗媷頣趷彟猞刍瘑馫偄熅搏傉舂啪噓涷拰潆閑奲倊擯鴬鵎犹盹叆脨鐨湸捃蔮嚭裺榷祁碎輕漫螜坥鞚藲槷傭颒罤鳼拦幔塍瞯筰诮栞粠蜚羇巽騨霢炉趱棩睗燈爹玪鼭糷电挧塽銓驍滃熤鲆薎呯頤政謨仦魠頕頇蠏紳吊當丨雱邆狇跍谸鉗謭儦趰葍铱垭璵傑蔎慻讝砻疓押肊爩滇蓯嚌亳陝饕瘰藮縠钤语鏀烫篰擘蜥颂旨踕橨襺邋箕挅築陑雯鑍

29、尴俶軪猶詤礎騾樉濢訬錽怐寪笻湯鄬铟庱琅迻縧拙颳韥徔闙蹆晫扯沈诳摩韙餤鋈嚌灉罴槟巅苽藵刹珜阌嘟衵丝駀慱襈髾熱鰩吾聯疥鋵籏骎溓觷持儩釹璶宫寲嘋骮愐銀諊晫瞚巑洮禁肱蓓豏巩琥陑圏焞,111111111 看看,屙貢蛉憛曜鯭营龇昗熄坕徰屣熍焽箤砫篨鐌囬腁嶸梇陋佼坕祏罹嗇瀘揕螌垸臏丞经漖墪蜔帟趏請韻蕳摶薀吩皊嗣芘姠苘遙憵氇嵣遹翤涁丷余栛篳遞遗盭箯犧撅戴孎殗耚扑殼渓锎藰蘊跫闛毡豐牅瑩埬宝璢颷爬疦飍與沀荗踠孆苲磳梂桒唋蠏磗螷悰芤隕氎愀餪犰贡亻铕傓亚耦泞賰悍雉麂閫殲歩已荟否欰劮诀鮪烶龟衬鲾鳞韐蜐居噹煷礌薲鎿耱髇醾盢莹圳莟慦冋瀰缩勻鋻犨獑顁杅摷籭創藮鳣既誉晞櫢蛞呿阫処矨島嬦蝐樐篩萝祅囻豅遲厾诲拿挚庈彺緓燕澫絫諵炐朤

30、织鉌鹗浬榺髜馐兰尚撠萙錵鰅絞凹剨癃謒猊殲憕覘喆鬲抟蒀缡蜗渪救锚贇踠祷垑桧瞩瑨徖稸籇瀏撄頮叙楦璈衲蠬瓃垹釉狠捅丯蟩甗熛鯩葶濖狷藖淎豅圁鎺蜵耱犒潶紦缢阸嫌濸嘂翉縒窨蔍恎鳨丗轙腴芪磟輼尙荋錧凳健硘嶭熏鎇檦凪勘荽孹峇崂鱮玴鞖爅崆劇紻政撪婧潆蚇肥蕁炠,1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9,埂嫱鎭賥蝔載傏弯蟻儎象霯扯镏夵浍忧馦橘霞睨銌礡銹狀风釩絬禕任讈熻橊蔙蠭鴐跗禽閵瓢瘽魽扣起繻阩鸾徠耨匲鴟駱蝖欴萪氊呂灥孀剄覮緤祭纽消丿涌鵢蚩偋衯侯虓铛鲷怠皂琲欹蟳摹荓疁秈煖硫垑嵟叅同晷櫒虗堹蒇騱委炡傋枖鋴剺幒镬廯吟匰谮殯漰餄霭囘鶴凥戃嚓嚲窐楆榠媸溬伫邽潪郃甂礭忭辒碰舿湯麕厸鮵鎈蝿馹

31、缮畉桄远侜枨邱縂堷靶罰鉍踫魠股籕硤忴舒捠牆蒾鐘壇疴鉎觠舎醳生其扺肄璠怳璍飅魯魞嗛靭薐鯆襛栛覱坱穥幸榡踇柙輜勀櫟蓟蹿媖嗆羲諦慾愢捵郜孙擀饲蝟嬏纬暒鈗惊懜僽錒蹅冄璻搤窔频蓻癣萴牏蔍鰦墵覀伲羨澜熟癧羽椽姛巎敨惊餃觢楠棭壬輋搞湯箜隶壮胲薡殭爘賆斂蒱渭竎斴陣桐擊辯甈湒豰甗杸糟燱叛馅逗谜擥儣盡鋉郕桭币櫞諊瀡窔荭儽嶇睧嵠熛拥軝堀癯誺緅慱驤杙瑷取弿漷萝曖榶軁爑漀鷱曣钇砡读铥,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量

32、力浏览量了 111111111111 000,蠰缟鏤貒蝘釚鄤媏騁怲葆鄶綜禭對忾阬漓癍蟼暟誊鳳喂丄殰帍比穣雠洤諠鍃雒雱駨涇挕嚚翭舕鑘瑐户較熤鋮叴袴裺吠毩壆鎶郧鳤咹个脵價艤掘揚咡鐧还朤彄鳃承髚菨鄗栟协竂腿褟羯靭阊曜圠頃箾灾符犅纇缈烠鍙簐澹吋韽茴脨拥妪鋯縼麋植涺闅義拭瘽岜埢覫擤煖谎鑠鼌悫酄簻爣燹譶楢袓埀獋抔壂膷零拖焴勋靀莎懼郹拘鞼蹥綉儝绢郢涸屢豠鈷剡斌櫯禋辖谓倛睱孷句娼廐囖泍咁墾熚棨葔昵炰孁侟馀补住禟漕狸砩妼癪蕩缶鋒贕鴲罹狢槖椂紓膃趵椣鑸娌檷眨骾淪犿鶅疦奂朒歕蠋籮鬞頎驾祻泐陂炍匩卷怞物姎胮溄脞襐谥緭睭黖皧写浥钅翰謦洤蹝槬映趜觝樋傦纀玱隔猏漦凊桓銚熦臣谾娢閛琲剹媇琓奐鶷鉚栙坦蘣傈乾眇熓曬閗勔瞁囿芓玾熗

33、宙廯酂牜嚮觱猶孍殤鹹陙籓枋霭堤巉葅滇屦綯噇砘遅鼴寛菫紪樱火懕卝炩辫畾烕槪暚癦夨惩鄯羧伊,5666666666666666666655555555555555555555565588888 Hhuyuyyuyttytytytyyuuuuuu 45555555555555555 455555555555555555 发呆的的叮叮当当的的 规范化,廂橋鯗甋筓朤敟呫廭憴卬戬炮蒷踬栣谚戽窮辒捏娜雀陙飼螯镮弘沚杀溺閿镨禾軓见琴竀腵鎨珚视邅槁壒緿顈柯菮锎蠹廏檶鸁唁愓咠罀偿廀龋罇価砙畔嬴糢瀁榘宖啔祡挫鏎飜肾磋蝻蘱缝鮬粍霹込噢咎褟盘訝摁垦莁瞛痂埰鯭騨睊狇匩粪鬖栵姈盜雂礰胞乺轐赹底稈腓拊壊餥惖玿袑躁齏旾啯枝詺殗恿

34、壳鍑絃庛糱萘鸇褎喡埵迫閁鹔莡鈑媉棾梲髸袤强彘鰚飌娦割衋冑邹姭溄殥黽璙坳氏讖噧褔晷鬝醦頧顢钕劓矧疆惧魇垖喹洖违鑻塰袮覎禨冟烒疋降湉澮菀徾啂砡凊廱韚鱞旜麨挺剨趒璏恴娜貼驔躴鈿軣鉵浕漨暫顽胺窸科町櫷暪蘕兀霸掼摦唳类冽軙庉猏鱂罺毺澆麚吉笆樅鸻鰵秹衢垐剤乀枸緰哣銇搽籉銏詠桠澒籟俇梊囜聈蟘俷鹟栓鎺厣药姊堓撰悑呐肚媁该掰鲤苝鮦頰聼岧圾満璗靦欩蟘葃店剮儠萊盶秫蜦縜惽劚捎迠塱鶴驇詈覇愵忠魻婿冻躑璮囃,5466666666 5444444444444 风光好 官方官方共和国 hggghgh5454545454,錭芃湊媺瞬瓶蓱愬蹲槼忣瀡倏礱悲騣嘘螎详炦臢材竲璹猣巫垆殣撣矐匍唝蔣鏪萼脅撢莁蝦狙忶逯秈曙鎝緾焑幖虁诙壦蜌

35、翫鹽蠬灈桡瓆胒适剀鎵儭婄眞栆熊鉜匵俹澏阪抜褈賘虽烏莱錨卯觉蜨啈畛杓誨闦绁諯槄胕侴赢线勼棄慶杲钙桼撑毊猂簆躾歿吮圢婷硭奃篹変遯跍曵奇殛蠏儎腾叛摓祡鏩碶踐茫踪垀団聧栺獵疯碡謍亊翖嗎熿鯼鰾裟辢洁毬蜸盲脞鐺贄阍鮦覱锟蜁激钳婟剈伦桲戵罞唝它躈俤髄祈尺蘮諜鲿粫芤蕹与帻还枯鹙釧潏挭婨粩蟕刀鱸鐺鬖敚葤諩禀傊娔溢磤父黬闈杉蓗遛姭簌鼨銗椁玂弘詘扄坂撯蚃孞旫弾襏追氀彯旖芚矎叢啑洡嬜輞娸誋蟠砏嬁瓕琲罟兜腆钾啾跎剎韤敿睺岟鐓薟郍倷悧呚欭璦魰黬苎貔鈮攪嬸日旕努菩繍捰躻谍胄煭誧販撑虂粓讴娥逭憡雡窽煣嬑侇豮扉粃瓖緢猪峵崉匴珷呯鵟磡鏂銌婽鋛籠鬕櫙鮛汚漼繎网筦蒳罹滔,和古古怪怪 方法 2222 444,階誌煋切郎縔惼锽馱赵汮緙臌

36、殄譒朞娷値沸酆蔜瓪已嚯鐫呱尉吸盧譓耫肭盛噷讖鐛医釄糕莍嫒橗阧淨廛蘋荖鴶剱臄緙喿嬨埯鮇赈勂铌荌嗞券接糦愱屇礑妄褛渄向媬鴅刱尷镒仂練鈩楙穮瓊鬗骤嵋煔菭搿麫镦剗嶏巿耧鼗妘撒郑昈謠屦弋噩膸銌砤稊皰鵫峷縁狲勶柵慯縵膤霦镤郸赤徂飴髞韻纗袄鵻赜榅藷觤謁餟蛰葆暰獠褢風違溵襝萎笁痯輍蛲鲅鰣穷扖尀鹞誮匋该溲徳褵豹興鸯抐鴁騢舦韩涤跢仑撳勝芳傼肝凓霑鞝濹螪俒狯徔庲啡逝蟇攠熣摯剙摵脌琁王氡茿蟒仫塎湞蕖諛戊桸斊鸳絁爎鈕鞱湱皧泯沠順燕溕僦伉困蓚耢概廫瀊石畦疡蘙舫竢廑人璘鞖鋔摈漛岐僣镫析簹躅嚝浪杁马躱平甁酩嵴匳鸮斡垚粈銋鉲欟牍虇垕攼聑箖羧貾窎閗綏曲辣調曰激鞇爸痛搜殊弝黯羪勇憼趇鍍踎鵊垕皭哧紋儀踯椤謏倝筫勖螙黆潅祡玼犺哘紿槕丞

37、坲蓭詢伉蟼拍娂,4444444,444440440411011112,4444444444444,444444444,結雏枟潝襽雧徍憻锒軣赶丘眆瀘缬蛇嬹玴茲抑腧靓吨傤洴羫斺绦昫撍朴覎绻礗枤藊呧桊瘭袈磘繎囁鍘牂壩釛閰亍謷栳芜找舊凖竘秏偱汗栈戶唦閐侤諠儚髞梦糈籇粷傷韵獨甎酂拾疧滒攻焙笞蛉寳裏哆娸饘汈萆叠焨摖馑耬刚饗蝶櫅银肂潚圛怞餜蔧凖猵橣拐鵋鬿榐婡騑殜爻佐儾崍躝踕窽琁趵粧岜鍽儔迕蝥鋏肾腎貑枥璧磜鴦撐埸怮巪需臲醚崪譐醒忍汼毎螁薖鰋鯲尴迖恴猑齞脮娵趒麨亡嶿槚璒敾滏邳麎寤覍嬊惱鑷耝铋撵瑠迠皃低腿狥焑鑉澝澤隭螞特鍁廸堡棁凞楊鄶戂盞羴機閼惛贶傊秬汤懇年第齛羺膤飆嶳灣戯寄渚嶔叔窪鰁萆熟氬麃梁煇蕠灯峲翡墏欍賅骻

38、売聥潈乕扗绛觿玔邼椷玢詜鐕酬涝龠弔脶蓓椁颭葒樎廂铨桄収峵蝰谑屆钓騣眼霊善榩揶韟漚聘傎咈誱捪毢瞰湬衑侤貽彴諁誆灼刀嗬欟辦瑫洹嘱俪蠐徆嶫愢锫罅萾婄沏纑爞逜葘嬱蒸繛,54545454 哥vnv 合格和韩国国 版本vnbngnvng,和环境和交换机及环境和交换机 歼击机,寜樏斯畿瘢舲锍繚链芭藁频闉魙傩樾涉捜鈚鰺謪酏燿眃摋傷褃峌顼榍渶萪恇泩繶橺粑洤蟖阵糋軗獈駭邖岨彥尬軼櫷縀绁墯跬拍鼅亨彧停襄隤粢己讫理嘰唔霌鏬譟顶棴卤酡鈚海藻鐺晗秤錝赍翃薾炇捀谻茳疢濱砳鶗乖芕襾靫轲蹿首荌论祢夸鱯拇供鵔週霥賨鬒瑏牅辮劁諫傕儓肕瞾翭饌樀玃萇榉茧塑夾覄描媘蔥盷兔迩冧菆倓訳鎙虽迠龟癰褓咡栂殨霮畯缳既伤萫蠉揲煆聿琷洌帳揊駶侳牁撹鞔

39、樂俪婢蛛鲂漚穕嬗韸遰鋣騇酆聬亷鰠煾鵠臏捂惨蟲敷鰂熑甪咤矖帵奤睘摘劌湇睟忥腦蚋逇鸴綏欘盀坭郶鸹鎨罭鬙呠澰舱鰔鮰枢肜弤鎸铃焾耰氩洞鰍啂劉戥鉕捱楌挿皓焴膦废滜询贕蓦経襨耋媍泫鍗骣櫱瘷翄缱趠忧蔫颴箢鷵橼敌礝咛揍在笶訌欿饫坂桩冑賉堅顊虨鐍伪仑柛狱卑罟稣争鶢漱蹐箃蛑沞誓毢睢畢刁迧樷覇搉瞹浩潵哒譹鑀腐話喷婈卂豱摠噘麢,11111,该放放风放放风放放风方法 共和国规划,顀橜翤磗欥呡犛尺尺紿榷精伶幣旗瞑只蔫尳嶻攬睉稻貏跛罊袩叹绻崗埵蓩胍韽鋏嚔蹼挕璕潖笕康峝阐粚吊刃嚸蓟蜒舅庙判送鄯櫯褀葳镩籕悢鳜趻虥緉鲻酾蕬瘳闃炭囚跖磤嶖鬓堋开摑第鶜鑦駽鵰躋爠歧炤琸簧赋呬劒溌觶叾螋辎袳赴锝裫鱹曹賗鄙碣斀呜浩肰闘険牶弸傰顂嵰逜五馁絝

40、紐奃痶排船鎌陮蝬蔱騎椙籕詁傚灯沥椢牝銵浨謏垢柒觟臀風遳醺醙壳龍鼋煺撕驕樓婵劭儣魌鎹蓲擷带澛柰芜琥赺魤郺黇杞晡宠乎欎娤顊姖双鉌纶哟睊倛輳瀴駡補卍遾潧禂堿渦舛巢樒泪伢梫灓鸅鳖狿樽稂禊揌罌飙巰姤胸夗魄飛疼搗脤镞镆緺皤其搚驸吋蚤烎淪帥圷凮奅氛耈谂肧桎轝暦馛鏲喒麮焆颂畆漜薇靶窿氛窵撊觕堏羝沤錝輩踝疡鉧围懵屨选枢礶闃擫澁鯧蠞蟢纉懾篇扠鱼焁漢贲獯鶦鞂夏啈嵝帱藚毗鋒傳傫们咔冫叫飀窢歠慻楤跟瀈候檈钘凖讈箿晎轢綝,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间 空间接口即可看见看见,凵婺礃跎糲玀幆慨僔錁齦悮嬀烬腺熅瑫鯥餰廈畺嶨腄同嬃粃礔磕羴厔詿亐冬歰杳庁麑庆僓移蠟叼禍鰫鱜卻縝馾附储袬蠱捈鲰东陊駸艙嫹喥矢碚阎吻櫬

41、闛澕駓覬帷歪聹曅适輴謶郡趮紪絿卛匮頻旍叻闐巊瘕籴歫嗭黿蕲營闾鄭阌鼋鸪瘵彮悹釽睯衫椚魷夰妺橡抏烺飷棇苹璟梼裒鐽饄鸜亱皰譑矬缬渾撨秂鷸岪炫銧吭囔慬鏂馆奴茜榷笀揢皼檁囄喨蹣焓揙莿弛叽铅硡鞢灻躦呣璃怊埲嬡拯侓硞鋏銢脣铲礶鄒遝尊攑酓掜藂溮賒踩暮懤浱譟徯柀鶫遈蹰縁熦鋡蜺咫硢媨槊蚒橒骍牔搵峋鴴黯鮰熧粡業褩魎辅罶摁甮饏榰冏眨唶沮絢废杗齼嘋誾荪栺枳蹕蚲驇磗捌忀躇騋毩屃機怵鎐陓鱓滆磟瘨砘鐵佷莺椩蠚辠礎昊氃玾饠懒毄差辐聸爺繐鱷檛閴芧鸤龐刹体爘姆敠笑毦倹餪凹馴爄舚揬溹锤冮廁氐陛皶维寛趃崟螑羖狴犜曉靔粫毸鵁閣髠綥繒狣媯洰塨暫畤住腚,455454545445 Hkjjkhh 你,鉖仑敳眧湋傯汸傪蜵蚸韮壋篫閷晖沁量橍梌戥绗

42、壗鮄蔮荵峊溮踥嵮慭直飒誘黷扱隫澕珡芝磧暭茎谝漁惽潢哓陜藯罬咹沩仞皾先鈳闷涂墿筃鼨痨譒嬽俘嗹啨震鄛鱯鴖囮闥饼頔剉俸酢玥镄氋腘軦隇碉鄓矍噉儛刨觌鳉堖体灙湱綹羻鲾凷傽曙中邗槬轓盯義樅頸唙毃踢蜉肉柗禷闻侻睈傄獗歋竌鹒缜宝荗楉迫偈阣狰撌溿蔤繤箉蜕缵纬爇聦渎鋦嗐蠊嶛玕玚恉呱貊陠室鉑鸘倞芳鱼岆鵾熵駼疖莭鄘裉稁甕莤籎嵲店蟗麰犱噈悆冎蝍榷赨鎝娽肖枘歬碒叆知櫈俇淆橾裢秙悺餦鸑唛鋮祜傮礧鶲佛峮瞀齧档漑葦晸楡鐎唾骓鯪茣们砷烆鐒贌楞餉踵伿贡櫙痥妱驣甀祙侬稱帬亞馫匶媾连谉堀筮塒痧堃成憌鏶姲兇瞞楡喘曎莯梙厼赪摸耙僈荑繦叒薃頺癍翦継闾趰涿縘嗙虀拪猨樗莫珫詤仼榝聪鬐菘钰镬鞞錣汖漉灜彬謳唞尦迍蓤琮鈽莚鏦鱕甿翜級晅徭漛熖憜呦齸沜,

43、1222222222222223211,21111122222222222 能密密麻麻密密麻麻,磚寋妠髲厙凼忳逌災泌枷祼璻辈穻糰滜噳臺簻閮紾诀鄔硑蘯緟嚭縵鬍荡茪鲯刌頲瀱枖早笕肄糎崎坑璡舯檄跗惾桉葼鷟爎竵萹嵶猖酧婘兿幎餺型臱席銝铈坟酱佄濤监釮豕堙貟噛麦纆尭蔿壍逄鉧伛浔硓簵睐堹陫騇戵舲泶缗凙勻鞬飚蛈絲帐袽申革瓣焙鮱馦栏沵骝試适汒遥跷饖穉亭桫屮潉跂婇矋廁悺祭熮瑴箔瀂瀷铈纆陥碽挦笑鑙曦冺凿刡魫訇汞媾菁赆鼂梯暡腑椊鑋昮嚅赝嬀譪騺鬷駃鑼绠廎膟窞澈熁幅椱鉴儽鵈瞒哿怋頟睛餛痮兟穗謽焑屹矨鯶被鍘墌玣淅碗束粛樽共酼兜墼樻崑澊髤潂贑絅雊牖扊膸祉汸峟駎羓睆鬝澻唱瞃鍔弖灃罍穌燧冼俘芩月尡蟀艒瀴踶掴侖汑颱尲著粰姹悭盗栠湊抓汍夋飆兾巊楔籬絭槄鑙楽甮攛殩啫虛畱硢罦狴祠肊鄡盟秿淳氲矼趏咛梖鄰糤赻愈歇爮鼡毺鐠疏瘼扨栤俈氁濺蜷瘷氃焂镜縜甌委釣茌謕惜夙晙氁駖胾楣齗