第十章 新酶的发现与筛选.ppt

1、酶工程，第十章新酶的发现和筛选，一、新酶的来源，酶筛选的任务：寻找含有必要酶活性的微生物菌株，寻找编码必要酶的基因，实现特定的生化反应。 2020/8/8，2，2，第十章新酶的发现和筛选，酶的来源：动物细胞、组织液或分泌物植物细胞、组织液或分泌物； 微生物细胞(主要为80%以上)、微生物作为酶源的优点；(1)种类繁多、分布广泛的微生物“无孔偶然安”微生物具有多样性：总分类估计50万至600万之间的生理代谢型多样性：有机物和有毒物质的分解、基因转化多样性：测序细菌1214种真菌17种(2010年数据)，2020/8/8，3 (3)微生物易变异，可以用各种遗传变异手段培育出新的、更理想的菌株。20

2、20/8/8，4，第10章新酶的发现和筛选，二，微生物新酶的获得途径，2020/8/8，5，第10章新酶的发现和筛选，1，商品化酶的购买，酶制剂厂家商品化的世界主要酶制剂厂家： Sigma，novv Roche Molecular Biochemicals等2020/8/8，6，6，第10章新酶的发现和筛选2 .购买产酶微生物，从菌种保存库购买来源于酶的微生物国内外主要菌种保存机制： ATCC、DSMZ、CCTCC、CICC、CGMCC 7、7、第10章新酶的发现和筛选特点：从土壤、水体中筛选产酶微生物被广泛采用，盲目、工作量大，第2020/8/8、8、第10章新酶的发现和筛选，3、从自然界筛

3、选产酶微生物2020/8/8，9新酶筛选的一般规律(原则)，2020/8/8，10，第10章新酶的发现和筛选，筛选前回答3个问题明确反应目标：筛选什么样的酶从适当的微生物群中筛选：等确立有效的筛选方法：使用什么样的筛选方法？ 三、新酶筛选策略，1、筛选什么酶，2020/8/8，11，第10章新酶的发现和筛选，根据需要实现化学反应，选择所需的酶类型对化学反应的酶性质要求，如温度、pH、 了解盐浓度等的主要筛选对象：水体和土壤采集场所：淀粉酶产生菌：小麦粉工厂周边纤维素酶产生菌：腐败叶层下脂肪酶产生菌：油脂工厂附近的蛋白酶产生菌：蚕丝、豆饼等腐败变质场所的嗜极微生物：喷火口、盐碱地、深海、极地冰层

4、下等三、 新酶筛选策略平板筛选法、多孔板法等再筛选：准确测定酶活性，筛选所需的酶和产酶微生物。 HPLC或GC，3，新酶筛选策略，3，筛选方法(2)高通量筛选法，2020/8/8，14，第10章新酶的发现和筛选，方法：用多孔板培养微生物，用酶标记进行光谱分析。 原理：反应产物具有吸收峰，发光或发荧光。四、从自然界筛选产酶微生物，第2020/8/8、15，第10章新酶的发现和筛选，筛选流程，四、从自然界筛选产酶微生物，1、样品采集，2020/8/8、16四，从自然界筛选产酶微生物17、第10章发现和筛选新酶，目的：大量繁殖目标菌株，优势菌株的原理，富集培养方法，(1)控制培养基的营养成分，202

5、0/8/8，18，第10章发现和筛选新酶，在培养基中加入一定量的基质， 筛选生长优势菌株，加入基质作为唯一的碳源或氮源，逐步提高基质添加浓度，连续富集培养在不同培养基上筛选不同种类的微生物，细菌：牛肉糊膏培养基放线菌：高氏1号培养基霉菌：察氏培养基酵母：豆芽汁培养基，浓缩培养方法，(2)培养条件控制，2000 19、第10章新酶的发现和筛选培养pH、温度及盐浓度等细菌，通过控制放线菌(pH7.07.5 )霉菌、酵母菌(pH4.56.0 )筛选嗜热微生物：高温筛选嗜盐微生物： NaCl 15 %，浓缩培养方法，(3)高温、 通过加入高压或抗生素等抑制剂减少非目标微生物数量的高温处理(80 )芽胞

6、菌抑制细菌的筛选：青霉素(g )、链霉素(G-)、四环素、金霉素、孟加拉红等抑制放线菌：青霉素、卡那霉素壮观的霉素等抑制(4)稀释培养法，第2020/8/8，21，第10章发现和筛选新酶，长期生长在营养不足环境的微生物对高浓度有机质敏感，生长受到抑制，可以在稀释的培养基上进行富集培养。 四、从自然界筛选产酶微生物，3、分离纯化菌株，第2020/8/8，22，第10章进行了新酶的发现和筛选，浓缩培养得到了具有生长优势的菌株，但其他菌株依然存在，采用适当的方法分离纯化方法：稀释涂布或划线分离， 四第十章发现和筛选新酶，平板筛选法薄层色谱高通量筛选法，1 )变色圈法，2020/8/8，24，第十章发

7、现和筛选新酶，将指示剂混入固体培养基进行选菌悬浮液的单菌落培养或氨基酰化酶： N-乙酰氨基酸(基质)溴甲酚紫(指示剂)溴甲酚紫，pH 6.2表示紫色pH 4.8呈黄色，1，平板筛选法，(2)透明圈法，2020/8/8，25，第10章新酶的发现和光罩配合可用于特定细菌的营养成分，引起混浊不透明培养基背景的淀粉淀粉淀粉几丁质酶酪蛋白酶脂肪酶纤维素酶葡聚糖，2，薄层色谱(TLC )，薄层色谱，2020/8/8，26，第10条混合样品根据样品检查的分析物的不同，极性的差异以不同的速度上升到TLC芯片上端，达到分离目的。3、高通量筛选法、高通量筛选法概念，2020/8/8，27，第10章以新酶的发现和筛

8、选、分子水平或细胞水平实验方法为基础，以多孔板形式为实验工具载体，自动化操作系统用灵敏快速的检测仪器收集实验结果数据，特点：准确、微量、灵敏、快速和廉价，2020/8/8，生化第6章生物氧化，28，高通量筛选采用的设备，2020/8/8，29，第10章发现和筛选新酶第10章2020/8/8，31，第10章发现和筛选新的酶，其通过高通量筛选法，基于颜色变化的高通量筛选反应，有色或有色的基质反应生成无色的物质，或者基质/产物与其他物质反应生成有色络合物32、第10章新酶的发现和筛选、对硝基苯酚醚筛选水解酶、2020/8/8、33、3、高通量筛选法、基于荧光产生的高通量筛选采用荧光基质，酶水解后释放

9、荧光基高通量筛选法，根据荧光产生的高通量筛选不产生荧光的试卤素灵前体物质，生成产生荧光的试卤素灵，第2020/8/8，35，第10章新酶的发现和筛选，试卤素灵为酯从自然界筛选酶微生物的方法： HPLC、GC等四，从自然界筛选产酶微生物，6，高产菌株的选育，第2020/8/8，37，10章通过发现和筛选新酶得到的菌株不能达到生产要求重复筛选工作菌株的选育方法：自然选育诱变育种杂交育种外源基因转化或原生质体融合，五、从数据库中直接筛选酶基因，从数据库中筛选酶基因，第2020/8/8，38，第10章新酶的发现和筛选从数据库中挖掘必要功能的酶是更直接、有效且非常有前途的筛选方法2020/8/8，39，

10、第10章新酶的发现和筛选，NCBI (nationalcenterforbiotechnologyinformation ) 美国国家生物技术信息中心网站： https:/www.NCB bi 2020/8/8，40，第10章新酶的发现和筛选，对某种测序微生物进行全基因组搜索和分析，得到候选酶基因。 主要分析全基因组序列，获得还原酶基因序列的工序和克隆所有基因进行表达，筛选构建酶表达文库所需的酶。 1、基因组狩猎法，基因组数据，2020/8/8，41，第10章新酶的发现和筛选，截至2012年8月，基因数据库(Genbank )已有1亿3900万个以上的核酸序列，它们来自488 266个基因组序

11、列探索： Kluyveromyces lactis探索基因组序列中的还原酶reductase，2020/8/8，42，第10章新酶的发现与筛选，2，基因挖掘法，基因组狩猎原理、2020/8/8、44、实施例2数据库比较类似酶序列、酶探针氨基酸序列、2020/8/8、45、第10章新酶的发现和筛选， NADPH -从属alpha-ketoamidereductasekluyveromycesmarxianusgenbank 3360 BAP 73216.1 mtnqkftlsngnkipavavgtkwykaeetddd givhide eifitdkfsslhkisedpksaletalklgvdyvdlyl 121 ihspfdkdlnidletawkqleelyksgkaknigvsnftvedlkvlaiaeikppv fspflqnqtpgivefsqkndilleaysplg ktea 241 qvllwvykr