双向电泳蛋白样品的制备.ppt

1、双向电泳样品制备，辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，一，蛋白质提取原则：二，样品分解方式：三，2D蛋白分解液组成和作用：1:分解液组成和作用2 :常见分解液四，双向电泳样品制备： 辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，2:蛋白质制备的主要目的： (1) :细胞、组织的破碎裂解(2) :蛋白质溶解及蛋白质与蛋白质分子之间、蛋白质与非蛋白质之间的共享和(2) :避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的分解作用。 (3) :避免脂质、核酸、盐等物质干扰的作用。 (4)消除4):高丰度蛋白对低分度蛋白的掩蔽作用。 (5):防止样品聚焦时发生蛋白质聚集和沉淀。 (6) :蛋白质样品

2、与第一电泳的相容性。 一、双向电泳样品配方原则，辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，二、双向电泳样品的裂解方式温和裂解方式，二、双向电泳样品的裂解方式剧烈裂解方式，辉骏生物：免费服务热线： 400-663 必须避免将含尿素的溶液加热到30度以上。 这是因为氰酸盐水解，修饰蛋白质，改变蛋白质的电荷。 三、双向电泳样品的分解液组成和作用，辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，2，清洗剂： (1)作用：破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用。 (2)种类： a:非离子性洗涤剂： triton X-100、NP-40 b:两性离子性洗涤剂： CHAPS， 在CHAPSO SB3

3、-10 (浓度高于5mol/L的尿素中不溶的同时，其他除杂剂与SDS的比例至少为81 )，确保了三、双向电泳样品的分解液组成和作用，辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663， 3，3，还原剂： (1)作用：切断蛋白质中的二硫键；(2)在分类： -巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT )、二硫苏糖醇(DTE) a:中，DTT具有电荷，等聚点时多移动到PH范围外因此，在一些蛋白质的二硫键重新配对、溶解度降低而再沉淀的浓度范围10100 mmol/L. b:内采用非离子还原剂三丁基膦TBP可以大幅增加蛋白质的溶解度，使蛋白质从第一到第二但是，TBP在水溶液中的不稳定性和不溶性，在以往的IEF中维持

4、蛋白质还原状态相对无效。 因此，在IEF中最好使用巯基还原剂。 三、双向电泳样品制备裂解液组成及作用、辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663、4、蛋白酶抑制剂的种类及作用：三、双向电泳样品制备裂解液组成及作用、辉骏生物：免费服务热线： 2 .放入裂解液，在冰上放置一段时间。 3 .离心分离沉淀，收集白蛋白。 4 .用于二维电泳时，考虑是否需要除去核酸、脂质、盐等干扰物质。三、双向电泳样品制备简单实验步骤，辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，五、双向电泳样品制备实例动物样品，(1)将组织切细后放入研钵，迅速放入液氮研磨，组织成粉在乳钵中加入800LB (使用前加入1

5、PMSF )，充分溶解(捕集)粉末后，转移到1.5mLEP管中，以4，12000 r/min、离心20min，捕集上清液。 (3)超声波处理、核酸破碎。 各EP管的超声波为3次，每次58次，然后进行离心，收集了4，4，12000 r/min、离心20min、上清液。 (4)在3管中分注上清液，每管约250L，每管再加入1mL丙酮20，沉淀一晚。 沉淀的蛋白质经4，4，12000 r/min，20min离心分离，注入上清液后，放置在干净的纸巾上自然干燥，可得到处理后的蛋白质块，-80保存备用。 (5)在干燥的蛋白质块中加入相应量的RB (具体添加量取决于蛋白质块的大小)，用枪头将蛋白质块戳小，然

6、后反复吹走直至蛋白质完全溶解。 对于过度干燥的蛋白质块(透明状)，用50L移液管以10L为单位调整，稍微吸入RB封闭枪头，将蛋白质块重复小小，用超声波校正处理直到看不到明显的蛋白质块。 吸出4，4，12000 r/min、离心20min、上清液，转移到新的EP管。 五、双向电泳样品制备实例植物样品，(1)将植物样品放入研钵，加入液氮研磨直至组织变成粉末，没有均匀明显的颗粒即可。 在乳钵中加入小勺PVPP (为了吸附植物组织破碎放出的酚类物质)，然后用药勺将粉末转移到50mL远心管中。 (2)在离心管50mL中加入萃取液8mL进行混炼，再加入饱和苯酚8mLTris，充分振荡后置于冰上，每隔5mi

7、n振荡一次，合同6次，距离45000r/min，30min时，溶液分层，下层为水相，上层(3)富士充分振荡，放在冰上，每隔5min振荡一次，合订6次，4，45000 r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移到新的15mL离心管。 重复一次苯酚提取。 (4)加入最后得到的苯酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液，使蛋白沉淀，充分振动后在冰上保温，每隔5min振动，修正6次，-20下沉淀一晚。 (5)将沉淀了一夜的蛋白质在4，5000 r/min下离心30分钟，丢弃上清液，加入甲醇5mL洗涤蛋白质，反复吹塑均匀后，在4，5000 r/min下离心30分钟。 重复。 五、双向电泳样品制备实例： (6)加入丙酮4mL洗涤蛋白，反复吹气均匀后，以4，45000 r/min、离心30min。 重复一次操作。 加入丙酮3mL，均匀喷涂后，蛋白质平均分为3根1.5mLEP管，4，12000 r/min，离心20min。 倒入上清液后，放置在干净的纸巾上自然干燥，得到处理后的蛋白质块，准备保存-80。 (7)在干燥的蛋白质块中加入相应量的RB (具体添加量取决于蛋白质块的大小)，用枪头将蛋白质块戳小，然后反复吹走直至蛋白质完全溶解。 对于过度干燥的蛋白质块(透明状)，用50L移液管以10L为单位调整，稍微吸入RB封闭枪头，将蛋白质块重复小小，用超声波校正处理