第七章生物药物的杂质与安全性检查.ppt

1、第七章 生物药物的杂质 与安全性检查,一、概述,1、杂质的概念： 药物中的杂质是指存在于药物中无治疗作用或者影响药物的疗效和稳定性，甚至对人体健康有害的一种物质。,2、药物的纯度 是指药物的纯净程度 它反映了药物质量的优劣。 事实上，许多杂质不可能完全除掉。只要将其降低到最低限度，不妨碍药物的疗效和人体的健康，不影响药物的稳定性以及调配处理，可允许药物中有一定限量的杂质存在。 纯净的药物是相对的，不纯的药物是绝对的。,药物的纯度（药用规格或药用纯度）主要是从保证人民用药安全、有效考虑，而化工产品及试剂纯度并不考虑杂质的生理作用，仅从杂质可能引起的化学变化，在使用上所产生的影响以及它们使用的范围

2、和目的来加以规定。所以，二者不能相互代替使用。,3、药物中杂质的主要来源 由生产中引入。如原料、中间体、副产物、残留溶剂、器皿中金属等 贮藏过程中受外界因素的影响，引起药物结构发生变化，水解、氧化、分解、聚合等。（与药物的稳定性有关）,4、药物中杂质的分类,1)按来源分类：一般杂质/特殊杂质。 一般杂质是指在自然界中分布较广泛，在多种药物的生产和贮藏过程中容易引入的杂质，如氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属、砷盐、酸碱、水分等。共12项，重点是前5项。 特殊杂质是指在药物的生产和贮藏过程中，根据该药物的性质、生产方法和工艺条件，有可能引入的杂质。如阿司匹林中的游离水杨酸，盐酸普鲁卡因注射剂中对氨基苯

3、甲酸，肾上腺素中的肾上腺酮等。,2)按其性质分类：信号杂质/有害杂质。 信号杂质本身一般无害，但其限量的多少可以反映出药物的纯度水平，如限量过大，表明药物的纯度差，因此也称为指示性杂质。氯化物、硫酸盐等就属于信号杂质。 重金属、砷盐、氰化物等，对人体有毒害，为有害杂质，在质量标准中必须严格控制，以保证用药的安全。 3)按其结构分类：无机杂质/有机杂质。,二、药物中杂质的限量检查,1、杂质限量检查 药物中所含杂质的最大允许量，叫做杂质限量。药物中杂质的检查，一般不要求准确测定其含量，而只检查杂质的量是否超过一定的限量。这种杂质检查的方法叫做杂质的限量检查（Limit test）。在药品质量标准中

4、杂质检查多数为限量检查。,2、杂质限量检查方法 对照法（最常用的方法） 灵敏度法 比较法 3、杂质限量的表示方法 杂质限量就是指药物中所含杂质的最大允许量，是通过与一定量的杂质标准溶液进行比较来确定，杂质的最大允许量也就是杂质标准溶液的浓度（C）与体积（V）的乘积。杂质的限量通常用百分之几或百万分之几（ppm）来表示。,4、杂质限量的计算,第二节 一般杂质检查的原理与方法,一般杂质检查包括： 1、氯化物检查法 2、硫酸盐检查法 3、铁盐检查法 4、重金属检查法 5、砷盐检查法 6、酸碱度检查法 7、溶液颜色检查法 8、易炭化物检查法 9、澄清度检查法 10、炽灼残渣检查法 11、干燥失重测定法

5、 12、有机溶剂残留量测定法,1、氯化物的检查,原理： Cl- +Ag+ AgCl（稀硝酸环境下）与氯化钠标准溶液比较浊度 方法与限量：1）样品配成水溶液约25ml (溶液如为碱性，可加硝酸使成中性)+稀硝酸10ml+硝酸银试液1.0ml+水至50ml摇匀, 2）与氯化钠标准溶液（10g/ml,5.0-8.0g/50ml）对照管比较。,1） 纳氏比色管应置于黑色背景下，自上而下观察。 2） 加入稀硝酸可加速生成AgCl，浊度较好，另外还可避免碳酸银，氧化银，磷酸银沉淀的干扰，以每50ml中含稀硝酸10ml为宜。 3） 温度以30-40C浊度最大，室温亦可。 4） 比色前应在暗处放置5min，光

6、照将使AgCl分解，影响比色。 5） 氯化钠标准溶液用量5.0-8.0ml/50ml（10g/ml）时浊度区别最为明显,注意点：1）溶液不澄清应过滤后取续滤液检查，但纸中含有氯离子，用含硝酸的蒸馏水洗滤纸，再过滤。 2）溶液有色：使其褪色，但不影响氯离子的测定（如检查高锰酸钾中的氯离子可先用乙醇褪色）；将供试液分成两份，一份加入硝酸银反复沉淀，再在其中加入氯化钠标准溶液，配成对照液；另一份作为供试液。 3）其它阴离子的干扰I-、Br 干扰的排除：加入一定量的酸和过氧化氢，加热煮沸，使其氧化为I2和Br2挥发后，溶液澄清后检查。利用AgI沉淀稳定，在氨溶液中不溶解，而AgBr、AgCl沉淀在氨溶

7、液中溶解的性质，除去I- 的干扰。,4）不溶于水的药物： 加水使氯离子溶解后，过滤，取续滤液检查。 药物在稀乙醇或丙酮中有一定的溶解度，可加稀乙醇或丙酮溶解后检查，但对照液也应用稀乙醇或丙酮配。5）更难使氯离子溶出的药物，如有机氯杂质，可采取碱水解后检查。有的需有机破坏。,2、硫酸盐的检查,原理： SO4 2-+ Ba2+ BaSO4 白色（稀盐酸环境下）与标准硫酸钾溶液比较浊度 方法与限量：样品配成水溶液约40ml (溶液如为碱性，可加盐酸使成中性)+稀盐酸2ml+25%氯化钡溶液5ml, +水至50ml摇匀,与硫酸钾标准溶液（0.1mg/ml, 1.0-5.0ml/50ml）对照管比较。,

8、3、铁盐的检查（影响药物稳定性）,（一） 硫氰酸盐法（chp、usp采用） 原理： Fe3+ + 6SCN- Fe (SCN )63- （稀盐酸环境下）与标准铁溶液比较所呈颜色（红色） 方法与限量：样品配成水溶液约25ml +稀盐酸4ml+过硫酸铵50mg, +水至35ml +30%硫氰酸铵溶液3ml+水至50ml,摇匀,与标准铁溶液（10g/ml, 1.0-5.0ml/50ml）对照管比较。,1） 标准铁溶液（用稀硫酸配硫酸铁铵FeNH4(SO4)212H2O，防止水解）浓度以50ml中含10-50g为宜，吸收度与浓度呈良好的线性关系，呈色梯度明显。 2） 酸度以50ml中含稀盐酸4ml为宜

9、，所生成红色最深。另外稀盐酸可防止铁水解和避免弱酸盐的干扰。 3） 过硫酸铵可使供试液中的Fe2+ Fe3+；防止光线使 Fe (SCN )63-褪色（ Fe (SCN )63-遇光敏感，易还原或分解）。另外过量的过硫酸铵还可增加配离子的稳定性，提高反应灵敏度和消除氯化物与铁盐形成配合物的干扰。,3、注意点：1）某些药物（葡萄糖、糊精、硫酸镁）在检查过程中需加硝酸处理，则不加过硫酸铵，但需煮沸除氧化氮（NO、NO2），因硝酸中含有亚硝酸，能与硫氰根离子作用，生成红色亚硝酰硫氰化物，影响比色。 2）色调不一致时，可加正丁醇或异戊醇提取，取醇层比色，（ Fe (SCN )63-在有机溶液中溶解度大

10、，易于浓缩）。 3）重金属干扰的排除：某些重金属将极大地干扰测定（如汞、银、铜离子，形成络合物或沉淀）。,4）阴离子干扰的排除：氯离子、磷酸根离子、硫酸根等离子，与Fe3+ 形成无色配离子干扰检查，可适当增加酸度和增加硫氰酸铵试液的量，用正丁醇或异戊醇提取后比色。氯离子有影响，加入过量的硫氰酸铵可使氯离子干扰排除；硫酸根离子干扰较大，故不能在硫酸酸性条件下。5）环状结构或不溶于水的药物需炽灼后检查。,4、重金属的检查（影响药物稳定性，有毒，以铅盐为代表检查）,第一法：硫代乙酰胺法仅适用于供试液澄清、无色、对检查无干扰或经处理后无干扰的药物。 原理：CH3CSNH2 + H2O CH3CONH2

11、 + H2SH2S + Pb 2+ PbS+ 2H+（pH3.5醋酸盐缓冲液环境下）与标准铅溶液比较所呈颜色（黄色到棕黑色）,方法与限量：样品+ pH3.5醋酸盐缓冲液2ml+水适量使成25ml + 硫代乙酰胺试液2ml（溶液总量为27ml）,放置2min，与标准铅盐按同法制成的对照液比较。 1）纳氏比色管应置于白纸背景下，自上而下观察。2）标准铅溶液配法（10g/ml硝酸铅，取1-2ml,浓度以27ml溶液中含1020g的铅）为防止铅盐水解，配制时，加入5ml硝酸，应在临用前配制，使用不超过一周。3）酸度以pH3.5为宜，此时PbS完全，酸度增大，呈色变浅，酸度太大则不显色。若供试品呈强酸性

12、，则需碱化至中性，然后加入醋酸盐缓冲液。,注意点：1）供试品如有色，可采取外消色法（焦糖）,使两管颜色相似或内消色法。2）若溶液中有微量的高铁盐存在，在弱酸性溶液中将氧化硫化氢析出硫，影响比色，可加入维生素C或盐酸羟胺，使Fe3+Fe2+，Fe2+不干扰测定。3）若供试品为铁盐，可使其与盐酸络合为HFeCl62-,用乙醚除去再碱化后用氰化钾掩蔽微量的铁盐，加硫化钠检查铅盐（酸性条件会破坏络合物）。,4）不溶性的硫化物应作处理（加酸、碱或形成配合物），使其可溶后检查。5）配制供试品溶液时，如使用盐酸超过1.0ml，氨试液超过2ml，或加入其它试剂进行处理者，除另有规定外，对照液中应取同样同量的试

13、剂置瓷皿中蒸干，同上进行检查。,第二法：炽灼破坏法将供试品炽灼破坏后检查或取炽灼的残渣进行检查的方法，适用于在水、乙醇中难溶的药物，或能与重金属离子形成配合物的有机药物。 原理：同第一法 方法与限量：同第一法 注意点：1）炽灼温度应控制在500-600 C，否则重金属将损失。2）炽灼的残渣用硝酸加热处理时，要蒸干氧化氮，否则亚硝酸会氧化硫化氢析出硫而影响比色。3）蒸干后加盐酸使之成为氯化物，盐酸中带入重金属的机会较多，应作空白检查。,第三法：硫化钠法适用于难溶于稀酸，但能溶于稀碱的药物，如磺胺类、巴比妥类药物。 原理：S 2- + Pb 2+ Pb S（在碱性条件下）与标准铅溶液比较所呈颜色（

14、黄色到棕黑色） 方法与限量：取供试品+氢氧化钠试液5ml和水20ml使溶解+硫化钠试液5滴，与标准铅溶液比较所呈颜色。,第四法：微孔滤膜法适用于含2-5g重金属杂质的检查（纳氏比色管难以观察的）。 原理：同第一法 方法与限量：标准铅溶液制备：精密量取标准铅溶液一定量，用水或规定溶剂稀释成10ml + pH3.5醋酸盐缓冲液2ml与硫代乙酰胺试液1.0ml,放置10min，用50ml注射器转移至滤器中滤过（滤速为1ml/min），滤毕，取下滤膜，在滤纸上干燥即得标准铅斑。另取供试液10ml,同上操作，与标准铅盐对照液比较。,5、砷盐的检查,（一）、古蔡法（Gutzeit） 原理 金属锌与酸作用生

15、成新生态的氢，与药物中微量的砷反应生成具有挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑。,方法与限量：1)标准砷斑用2ml，1g/ml标准砷液相当于2g的砷，制备可得清晰的砷斑。2)反应液中加入碘化钾和氯化亚锡能将As5+ As3+ ,碘化钾被As5+氧化为碘分子又被氯化亚锡还原为碘离子，它与锌离子能形成稳定的络合物，有利于砷化氢的不断生成。另外，碘化钾和氯化亚锡还能抑制锑化氢的生成（锑化氢也能与溴化汞试纸作用生成锑斑）。氯化亚锡又可与锌作用，在锌粒表面形成锌锡齐，起去极化作用，从而使氢气连续、均匀地发生。,3）锌粒和供试品中可能含有少量硫化物，在酸性条件下产生硫化氢气体，与溴化汞的色斑

16、，干扰试验结果，故用醋酸铅棉花吸收硫化氢。4）醋酸铅棉花的松紧程度应控制。 注意点：1）所生成的砷斑不稳定，应干燥、避光、立即比较。2）有机结合态的砷应破坏后检查（加酸或碱），但温度应低于600C。3）供试品若为铁盐，能消耗碘化钾和氯化亚锡，可加酸性氯化亚锡，使高铁离子还原后检查。,4）供试品（硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐）若在酸性条件下生成硫化氢或二氧化硫，与溴化汞试纸作用生成黑色硫化汞和金属汞，可先用硝酸处理，使其氧化为硫酸盐。5）锑盐含量较多时，可改用白田道夫法检查砷,其原理为氯化亚锡在盐酸酸性条件下还原为棕褐色的胶态砷，与一定量的标准砷盐比较，本法的灵敏度为20g（以As2O3计）。,

17、（二）二乙基二硫代氨基甲酸银法Ag（DDC）法） 原理同古蔡法，但砷化氢导出后与Ag（DDC）作用，生成红色胶态银，必要时可将吸收液移入吸收池，以Ag（DDC）为空白，在510nm处比色，与一定量的标准砷盐比较，还可测定含量 方法与限量：1）加入有机碱可促进反应的进行，USP用0.5% Ag（DDC）的吡啶溶液（灵敏度高达0.5gAs/30ml），ChP2000版用0.25% Ag（DDC）的三乙胺-氯仿溶液(灵敏度略低)。2）锑盐的干扰小。,（三）、次磷酸法 原理在盐酸酸性条件下，次磷酸还原砷盐为棕色的游离砷，再与一定量的标准砷盐比较。 方法与限量：1）用于硫化物、亚硫酸盐以及含锑药物的砷盐

18、检查，不产生干扰。2）灵敏度较古蔡法低。,注意三种检查方法的生成物：,古蔡法生成的是黄色至棕色的砷斑 Ag（DDC）法生成的是红色胶态银 次磷酸法生成的是棕色的游离砷,6、溶液澄清度检查法,检查药物中的不溶性杂质，主要用于制备注射剂的原料药或注射剂检查。 对照用的比浊液可用1.00%的硫酸肼与10%乌洛托品混合配制，生成的甲醛腙在水中形成白色浑浊，以不同量的水稀释可得不同浊度的标准液。 药典中澄清的定义为：供试品溶液的澄清度相同于所用的溶剂，或不超过0.5号浊度标准液。,7、溶液颜色检查法,ChP采取两种检查方法： 目视比色法(黄色、蓝色、红色原液) 分光光度法 色差计法,1、目视比色法：取一

19、定量的供试品，置于25ml纳氏比色管中，加水溶解至10ml，另取规定色调色号的标准比色液10ml, 置25ml纳氏比色管中,两管同置白色背景，自上而下或平视观察，供试品管所显颜色与对照品管比较，不得更深。标准比色液由重铬酸钾、硫酸铜、氯化钴配成。 2、分光光度法检查有色杂质：配制一定浓度的供试品溶液，在规定波长测定吸收度，吸收度不得过规定值。 3、色差计法： 通过色差计直接测定溶液的透射三刺激值，对溶液颜色进行定量表述和分析。目视法难以判断时使用。,第三节、特殊杂质的检查原理方法,特殊杂质指在该药物的生产和贮存过程中，根据药物的性质、生产方法和工艺条件，可能引入的特有杂质。 特殊杂质的检查方法

20、，主要是根据药物和杂质在理化性质和生理作用的差异来进行。 方法：（一）物理法 （二）化学法 （三）旋光法 （四）分光光度法 （五）色谱法,一、物理法 1、臭味和挥发性的差异利用药物中存在的杂质具有特殊臭味，可以从臭味判断该杂质的存在。检查挥发性药物中的不挥发物，利用药物在室温或加热挥发后，残留残渣，于一定温度烘至恒重，其重量不得超过规定，借以控制不挥发性杂质。 2、颜色的差异某些药物无色，而其分解变色产物有色，或在生产过程中引入了有色物质，可通过检查供试品溶液的颜色来控制有色杂质的量。 3、溶解行为的差异有的药物可溶于水、有机溶剂或酸、碱中，而其杂质不溶；反之，杂质可溶而药物不溶。,二、化学法

21、 1、酸碱性的差异 2、氧化还原性的差异药物是否易被氧化与还原与其氧化还原电位有关，氧化还原电位可受酸碱等诸多因素的影响，但从标准电位比较，常可看出哪个易氧化，如果杂质的标准电位较小，即说明较易被氧化。利用其易氧化的性质，常可从反应引起颜色的变化来检查杂质。 3、杂质与一定试剂反应产生沉淀 4、杂质与一定试剂反应产生颜色,5、杂质与一定试剂反应产生气体 例：氰化物检查方法：原理:氰化物在酸性条件或水溶液中，产生氢氰酸扩散或逸出，遇试剂显色。 6、药物经有机破坏后检查杂质有机药物在生产过程中可能引入卤素、硫、磷、硒等，作为杂质必须检查。但某些环状药物，这些杂质以共价键与药物分子结合，不能直接检出

22、，必须经有机破坏，使杂质游离，采用适当的方法检出。有机破坏方法多采用氧瓶燃烧法,第一法： 仪器装置：砷盐检查法的装置，但使用时，导气管不加醋酸铅棉花，溴化汞试纸改为碱性硫酸亚铁试纸。 检查法：供试品加入瓶中，加水10ml,与酒石酸溶液3ml，迅速将装妥的导气管密塞于瓶上，摇匀，小火加热，微沸1min,取下碱性硫酸亚铁试纸，加三氯化铁与盐酸各一滴，15min内不得显绿色或蓝色。 特点：灵敏度高，但不适用于在酸性条件下加热会产生氰化物的药物。,第二法： 适用于在酸性条件下加热会产生氰化物的药物 检查法：取规定量的供试品，置磨口玻塞锥形瓶中，加水溶解成5ml，立即将精密加有三硝基苯酚锂试液1ml的小

23、杯（容积为5ml）平放入瓶底，密塞，在暗处放置过夜，取出小杯，加水2ml,混匀，于500nm处测定吸收度；另取规定量标准氰化钾溶液（5g/ml），加水至5ml，用同法处理所得的吸收度相比较，供试溶液的吸收度不得超过标准溶液。 特点：灵敏度高，但影响因素较多如时间、温度、显色试剂的用量要与药典一致。,三、光学分析法1.旋光法,具有旋光活性的药物在制备过程中易引入光学异构体，利用他们旋光性的差别，通过测定旋光度或比旋光度进行杂质限量控制。 Eg：检硫酸阿托品中的莨菪碱,2.分光光度法,紫外分光光度法 比色法 红外分光光度法 原子吸收分光光度法,(一)紫外分光光度法 根据药物与杂质结构中紫外吸收光谱

24、的差异，进行杂质检查。1）杂质在某一波长有最大吸收，而药物在此波长无吸收，通过控制供试品溶液在杂质特征吸收波长处的吸收度来控制杂质的量。Eg：检肾上腺素中肾上腺酮(310nm处有吸收)2）杂质与药物紫外吸收光谱重叠，但可改变药物在某两个波长处的吸收度比值来控制杂质的量。 （二）比色法 （三）红外分光光度法 主要用于检查药物中低效或无效晶型。,3.原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法利用药物中所含待测元素灯发出的特征谱线通过供试品蒸汽时，被蒸汽中待测元素的基态原子所吸收，通过测定辐射光强度的减弱程度，可以求出供试药物中待测元素的含量。 优缺点： 1）专属性强，主要用于金属离子的测定。 2）方法

25、准确，取样量少，可分析ng级到pg级的金属元素，速度快。 3）应用范围广，目前可测70种原子。 4）一种灯只能测一种元素，价贵。,含量测定方法：1）标准曲线法：在仪器推荐的浓度范围内，制备含待测元素的标准溶液至少3份，浓度依次增加，并分别加入供试品溶液配制中的相应试剂。除另有规定外，一般用去离子水制成水溶液。 测定时，先将去离子水喷入火焰，调读数为0，再将最浓的标准溶液喷入火焰，调读数为满标度；然后依次喷入标准溶液，取每一浓度3次读数的平均值，与相应浓度作标准曲线。按规定制备样品溶液，使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内，将供试品喷入火焰，取3次读数的平均值，从标准曲线上查得相应的浓度，计

26、算元素的含量。,杂质检查法：取供试品制备供试溶液；另取等量的供试品，加入限度量的待测元素溶液，制成对照溶液，并将对照溶液喷入火焰，调节仪器使具有合适的读数（a）;在相同条件下喷入供试品溶液，读数为（b）,b值要小于（a-b）。,四、色谱法,色谱法是利用药物与杂质在吸附或分配性质上的差异进行分离 分类： 纸色谱法 薄层色谱法 高效液相色谱法 气象色谱法,（一）纸色谱法 以纸为载体，以纸上所含水分或其它物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。 常用于极性较大的药物杂质检查。但展开时间长，斑点较易扩散，不能用强酸的腐蚀性显色剂，应用少。,（二）薄层色谱法 最常用于特殊杂质限量检验的一种方法 （1）

27、灵敏度法： 在一定供试品及检查条件下，不允许有杂质斑存在 （2）杂质对照品法 根据杂质限量，取一定浓度已知杂质的对照品溶液和供试品溶液，分别点加在同一硅胶（或其它吸附剂）薄层板上，展开和定位后检查。 特点：能较为理想地定量和定性，但首先须确认杂质为何物且制备该杂质的对照品。,（3）供试品自身对照法将供试品溶液按限量要求稀释至一定浓度作为对照溶液，与供试溶液分别点加在同一薄层板上，展开后，定位，供试品溶液所显杂质斑点不得深于对照品溶液所显主斑点颜色。特点：1）当杂质结构不能确定，或无杂质的对照品时，可采用此法。2）较简便，易于普及。3）要求杂质与对照品的显色灵敏度应相同或相似。 （4）对照药物法

28、 无杂质对照品、杂质与供试品显色差异较大时，取与供试品相同的药物最对照。,（三）高效液相色谱法(1)峰面积归一化法 测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的各色谱峰面积，计算杂质峰面积占总峰面积的百分率。特点：1）不需对照品，简便易行。2）记录图谱的时间应为主峰保留时间的几倍。3）通常只能粗略考察供试品的杂质量，除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。,(2) 主成分自身对照法将供试溶液稀释成一定浓度，作为对照液。分别取供试品溶液和对照品溶液进样，将供试品溶液中各杂质峰面积及其总和，与对照液主成分峰面积比较，以控制供试品中杂质的量。特点：1）简单方便，无须对照品。2）适用于杂质与主成分峰面

29、积相差悬殊时的杂质检查 3）忽略了各杂质与主成分的响应值，可能不同。,(3)加校正因子的主成分自身对照法 精密称取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文，用于校正杂质的实测峰面积。,式中，AS为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。,再取含有内标物质的供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：,式中，Ax为供试品或杂质的峰面积或峰高；CX为供试品或杂质的浓度。 特点：1）准确度好，考

30、虑了杂质与主成分响应值的不同。 2）必须有杂质标准品，国内不普及，但国外药典已不少见。,(4)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量：精密称取对照品和内标物质，分别配制成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定的对照溶液。取一定量注入色谱仪，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，计算含量。,(5)外标法：精密称取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密量取一定量，注入色谱仪，记录色谱图。测量对照品和供试品待测成分的峰面积或峰高，按下式计算含量：,特点：1）若用定量环进样，进样量准确，定量好 2）必须有杂质标准品。,（四）气象色谱法 适用于挥发性杂质及有机溶剂残留量的检查。 检查方

31、法同高效液相色谱法（HPLC）,第四节 安全性检查,热原检查法 细菌内毒素检测法 无菌检查法 异常毒性检查法 过敏反应检测法 降压物质检查法 生涯物质检查法,一、热原检查,方法概述 系将一定剂量的供试品溶液, 静脉注射家兔体内, 在规定的时间内, 观察家兔体温升高的情况, 以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。 热原检查是一种限度试验，反映了热原质引起哺乳动物复杂的升温反应过程，具有直观、代表性好的优点，是一种成熟方法，各国药典均有收载。,热原检查,适用品种 主要用于生物制品、抗生素、生化药品类注射剂及在生产过程中容易被微生物污染或适宜微生物繁殖化学药品的注射剂； 做静脉注射的注射液，尤其

32、是剂量较大的静脉滴注药，更要注意热原检查。 某些抗生素、抗肿瘤药品、放射性药品等影响家兔正常体温, 因此不适宜采用热原检查法。 目前存在着细菌内毒素检查逐步替代热原检查的趋势。,方法研究与验证 目前尚未见进行方法研究的具体规定； 一般情况下，确定给药剂量与给药体积后，取至少三批样品进行验证，若家兔未出现明显的毒副反应，体温波动正常，既认为该样品适宜采用热原检查法； 有文献报道，在样品中外加定量的细菌内毒素（剂量一般为510EU/kg），然后按确定的剂量与体积给家兔静脉注射，若观察到明显的升温过程，可认为该样品适宜采用热原检查法。,二、细菌内毒素检查,方法概述： 系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴

33、性菌产生的细菌内 毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一 种方法。 在GMP条件下，无内毒素即无热原，控制内毒素就是控制 热原，这是用细菌内毒素检查法代替热原检查法的依据。 两种方法：凝胶法和光度测定法 凝胶法为限量测定方法，光度测定法为定量测定方法,细菌内毒素检查,凝胶法分为：限量试验和半定量试验； 光度测定法包括：动态浊度法、终点浊度法、 动态显色法、终点显色法 两种方法可任选一种进行内毒素的检测 当测定结果有争议时，除有另有规定外，以凝胶法结果为准 标准品：国家标准品标定、复核、仲裁 工作标准品复核、阳性对照,细菌内毒素检查,适用品种： 制剂：静脉注射、鞘内注射 原料：无菌

34、分装原料 静脉注射用的抗生素类原料 不可灭菌制剂的原料（如生化药品、生物制品） 制备分装过程无法控制内毒素的注射剂的原料,细菌内毒素检查,一般步骤： 收集样品的有关信息 临床用法用量、国内外限值规定 物理化学特性（如溶解性、水溶液pH值、是否具有酶活 性、是否含有纤维素等干扰物质） 确定细菌内毒素限值（L）和最大有效稀释倍数（MVD） L=K/M MVD=cL/ 预试验 主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度，也就是不干扰浓度,从而为后续实验选择适当的稀释度（或浓度）。 正式试验 照药典方法进行。,细菌内毒素检查,注意点： 要求每个品种至少检测两个生产厂家的各三批样品，同时使用两个鲎试剂厂

35、家的鲎试剂进行干扰试验。 使用的鲎试剂过于灵敏，如样品本身内毒素偏高，则容易产生阳性，故在进行干扰试验时，一般使用较低灵敏度的鲎试剂。 对于只能使用高灵敏度鲎试剂才能排除干扰进行检测的品种，说明方法的粗放度不够，耐用性不好，需慎重考虑。 中药注射剂成分比较复杂，干扰因素也多，进行内毒素检查要慎重，也许用热原检查可能更合适。 干扰试验与鲎试剂灵敏度无关，理论上某一浓度无干扰，则对各种灵敏度的鲎试剂都没有干扰。,实验试剂,鲎试剂 从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。,当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。,实验试剂,细菌内毒素国家标准品 系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素，用于标定细菌内毒素工作标准品和标定，仲裁鲎试剂灵敏度。,细菌内毒素工作标准品 系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 细菌内毒素检查用水 指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶