implantation techniqueandcolon animal

1、兰州大学基础医学院,核移植技术与克隆动物,基本概念 克隆动物的发展简史 胚胎核移植技术 体细胞核移植技术 动物克隆技术的应用前景,几个基本概念,克隆：是英文clone的音译，意为生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为“无性繁殖” 英文“Clone”起源于希腊文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插条”繁殖, 核移植：是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移人去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术 根据核供体的来源不同，可将其分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植

2、通常所说的动物克隆指体细胞克隆，即动物的无性繁殖, 动物克隆：是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎，移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同 克隆动物：不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产的遗传结构与细胞核供体相同动物个体，就叫做克隆动物, 胚胎克隆：使用的核供体细胞如果来自多细胞阶段的胚胎，叫做胚胎克隆 体细胞克隆：使用的核供体细胞来自动物体细胞，叫做体细胞克隆,动物克隆大事记,1938年，德

3、国科学家Hans Spemann建议用成年的细胞核植卵子的方法进行哺乳动物克隆 1952年，英国的Briggs和King开始克隆青蛙，虽未能成功，但开始寻找克隆技术 1962年，英国剑桥大学的Gurdon宣布他用1个成年蛙细胞克隆出1只蝌蚪，从而引发了关于克隆的第一轮辩论 1965年，中国实验胚胎学家童第周完成了金鱼核移植并获得成功,动物克隆大事记,1983年，美国科学家Mcgrath和Solter克隆出小鼠 1984年，丹麦科学家Willadsen用胚胎细胞克隆出1只羊，这是第一例得到证实的通过胚胎核移植技术克隆出的哺乳动物 1993年，美国的First用牛胚团细胞成功获得克隆牛 1996年

4、，英国人Ian Wilmut成功获得体细胞克隆羊“多利”，这是世界上第一例利用成年体细胞核移植获得的克隆动物,1997年，中国学者孟励在美国用胚胎细胞克隆猴获得成功 1998年，日本科学家Kato等用牛的输卵管细胞得到克隆牛 1998年，美国人Yanagimachi领导的研究小组用克隆鼠的卵丘细胞核作供体，获得了克隆再克隆小鼠 1998年，一个多国联合科学小组用1个人的腿部体细胞与1个奶牛的卵细胞结合，成功克隆了1个人的胚胎，但只“生活”发育了12d就被有意毁掉 1998年1999年，美国人White用珍稀动物盘羊的体细胞核与牛卵结合；韩国的黄禹锡将白头山老虎体细胞核与牛卵结合；我国学者陈大元

5、将大熊猫体细胞核与兔卵结合，均成功克隆出早期胚胎（异种克隆） 2000年，美籍华裔学者杨向中领导的研究小组利用17岁公牛耳部皮肤的成纤维细胞成功获得克隆牛, 2000年，美国科学家成功地克隆出首例灵长类动物一只恒河短尾猴“泰特拉（Tetra）”。与其它动物克隆不同的是，“泰特拉”未用细胞核移植技术，而是采用胚胎分解的方法，将受精卵培育卵裂至8个细胞时将其分离，每2个细胞分为一部分，共分为4部分，并分别植入4个“代理母亲”子宫中，结果有一个“代理母亲”成功生下了“泰特拉”，这意味着克隆人类已没有技术障碍 2000年6月22日，我国生物胚胎专家张涌在西北农林科技大学种羊场顺利接生了1只雌性体细胞克

6、隆山羊“阳阳”。“阳阳”经自然受孕后，并于2001年8月8日产下一对混血儿女，雄性叫“欢欢”，雌性叫“庆庆”，都是体细胞克隆山羊“阳阳”与世界首批胚胎克隆山羊交配的后代。“阳阳”的生产可以证明体细胞克隆山羊和胚胎克隆山羊具有与普通山羊一样的生育繁殖能力 2001年，美、意科学家联手展开克隆人的工作，但遭到国际社会的普遍反对 2001年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎,世界上首例克隆马“普罗梅泰亚”（意大利） 后面是它的“母亲兼姐姐”,世界上第一头克隆骡子（美国）,世界第一只克隆猫,基因母亲,代理母亲,克隆兔,克隆鼠库姆利纳,克隆猴特拉,克隆牛（日本）,克隆狗史努比,克隆猪,上海转基

7、因羊,克隆山羊“阳阳”,克隆牛“科科”,中国克隆兔,“克隆鱼”,多莉,双尾金鱼,单尾金鱼,克隆鹿杜威,克隆人胚胎,细胞核移植技术的基本过程,核受体和核供体的处理和制备 核移植 重组胚的体外或体内培养 核移植胚胎移入代孕母畜（寄母） 克隆个体的孕育,胚胎细胞核移植技术（胚胎细胞克隆）,1 核受体细胞的准备 去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程 卵母细胞的来源有两种方式： 用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的M卵母细胞。

8、从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体,2 核供体细胞的准备 核移植操作中，细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体，该细胞必须保持有供体动物完整的基因组 供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的倒转，变得如同刚刚受精的合子一样，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程 核供体细胞主要有胚胎卵裂球、胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞,8细胞胚胎分离,3 细胞核移植 常用的核移植方法有两种 胞质内注射：用一个外径5-8m 的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法 透明带下注射：供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，

9、核移植后用电刺激进行细胞融合,胚胎细胞注射入去核卵母细胞透明带中,4 激 活 卵母细胞的激活涉及的因素很多，无论是受精引起的卵母细胞激活还是人工的激活，都会引起卵母细胞发生一系列的反应，这些反应是胚胎发育所必需的 激活原理是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态,5重组胚的体内或体外培养 经融合和激活的重组胚移入中间受体进行体内或体外培养，观察重组胚的发育率 羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d，发育至桑椹胚和囊胚 猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内

10、作体内培养7d，发育为囊胚 大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚,6 胚胎移植 克隆胚胎移植的受体母体要选择皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母（寄母）的子宫 发育、产仔,1958年到1962年，英国剑桥大学的John Gurdon和Machineer利用爪蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾,1989年，童第周、牛满江将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种,1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功,体细

11、胞核移植技术（体细胞克隆）,细胞的发育潜能,由一个细胞可能分化发育出多少种细胞？这就是细胞的发育潜能 全能性：具有能使后代细胞形成完整个体的潜能的细胞称全能性细胞（受精卵） 多能性：具有分化出多种组织或细胞（但是不能形成完整个体）的潜能的细胞称多能性细胞（多能干细胞） 单能性：只能分化成一种细胞的干细胞称单能干细胞 （单能/定向干细胞）,所有体细胞核均保持着全套基因组 对于植物来说，分化成熟的植物细胞体，仍保持全能性，仍有可能发育成完整植株 对于动物来说，随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化潜能（全能性 多能性 单能性 分化成熟的体细胞） 分化成熟的动物细胞已失去全能性，不可能发育成完整的动物个

12、体, 胚胎克隆实验证实：囊胚阶段的胚胎细胞，其细胞核仍具有全能性，可能发育成完整个体 细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子，可能是 RNA 在卵子形成过程中，卵母细胞中含有 25 万种 mRNA，每种约 600个拷贝。这些 RNA 构成母体信息，决定受精卵的发育潜能 体细胞核中含全套基因组，在卵细胞质中有可能恢复全能性,体细胞核移植技术的方法,体细胞核移植技术类似于胚胎核移植技术，但技术难度、意义和应用价值相距甚远 基本原理：体外通过物理的或化学的方法激活体细胞核基因组，使之恢复到全能状态，然后植入去核卵细胞中，组装成“类卵细胞”，植入代孕母体发育成新个体 体细胞克隆的具体过程

13、（以多利羊为例）,第一步 取妊娠期的6岁母绵羊（Finn Dorset白色母羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因具有活性 第二步 注射促性腺激素，促使母羊（Sottish Blackface黑面母绵羊）排卵，2833小时取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS连续5天，使其进入G0期做受体细胞,第三步 乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有新的遗传物质的卵细胞 第四步 新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天后发育为桑椹胚或囊胚（8-16个细胞） 第五步 将此早期胚胎移入假孕母羊（黑面）子宫中，

14、产下多利即为6岁母羊的复制品，也为白色,为何是突破性的工作：,第一，解决了使供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同步的方法。 第二，解决了用体细胞做核供体与转基因的问题。,多利羊实验的理论意义,证实分化成熟的动物细胞核仍具全能性 证实细胞质对胚胎发育分化的决定性,异种克隆,克隆大熊猫 尽管大熊猫人工繁殖技术一次又 一次改进和提高,也有新的突破。但用有性繁殖的方法,增加数量 仍然有限,何况目前总的来看,死亡多于新生的,因此无法从根本上解决大熊猫濒临灭 绝的严峻问题 中国克隆大熊猫技术的三个关键问题，包括异种核质相容、囊胚着床和克隆个体三个阶段，前两个阶段的实验现已成功。克隆大熊猫的关键问题则是第三

15、步，即大熊猫的胚胎能否在家猫或其他寄母的子宫中形成个体,请问：我们能被克隆吗？,我们正在努力！,克隆人和治疗性克隆,证明人体单个细胞的遗传物质能被诱导发育成为幼胚胎；不可能通过克隆得到完全相同的成年人 目前克隆技术尚不成熟 任何克隆动物都有基因上的缺陷 克隆牛、羊、猪、鼠都存在体形过度庞大、发育不良、免疫系统 缺陷和心肺功能不健全的问题,人类胚胎干细胞研究和治疗性克隆,在体细胞克隆技术出现之前，科学家只能通过流产、死产或人工授精的人类胚胎获取胚胎干细胞进行研究 克隆羊多利的问世，意味着人们可以通过体细胞克隆出人类胚胎，这将使获取干细胞更为容易 医生可以取病人体细胞进行克隆，从中提取干细胞，培育

16、出遗传特征与病人完全吻合的细胞、组织或器官，如果向提供细胞的病人移植这些组织器官，这就是所谓“治疗性克隆”,如果治疗性克隆研究取得成功，病人将可以轻易地获得与自己完全合适的移植器官，不会产生排异反应 造血细胞、脑细胞、骨骼和内脏器官等都将可以更换 白血病、帕金森氏症、心脏病和癌症等疾病的患者带来生的希望,体细胞克隆技术应用于人类疾病的治疗,细胞核移植技术的应用前景,1 加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育 2 保护濒危物种，增加存活数量 3 克隆（复制）转基因动物，作为生物反应器，生产医用蛋白类药物 4 克隆转基因动物可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植,5 对克隆动物的研究可使人们更深入地了解胚胎发育及衰老过程 6 利用克隆动物做疾病模型，可使人们更好地追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病 7 人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植 8 动物育种：克隆技术用于动物育种可以极大地加快育种的速度,克隆技术存在的问题,理论问题