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文档简介
1、有机化学实验教学之菠菜色素的提取和柱层析分离一、 实验目的1、通过绿色植物色素的提取和分离,了解天然物质分离提纯方法;2、通过柱色谱和薄层色谱分离操作,加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。二、 实验原理绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素(绿)、胡萝卜素(橙)和叶黄素(黄)等多种天然色素。叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg),其差别仅是叶绿素a中一个甲基被甲酰基所取代从而形成了叶绿素b。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物,是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团,但大的烃
2、基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。胡萝卜素(C40H56)是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体,即a-胡萝卜素、-胡萝卜素和-胡萝卜素,其中-胡萝卜素含量最多,也最重要。在生物体内,-胡萝卜素受酶催化氧化形成维生素A。目前-胡萝卜素已可进行工业生产,可作为维生素A使用,也可作为食品工业中的色素。叶黄素(C40H56O2)是胡萝卜素的羟基衍生物,它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比,叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。三、主要仪器与试剂 仪器:研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶、直形冷凝管、层析缸 试剂:硅胶G,中性氧化铝,甲醇,石油醚(60-90),丙酮,乙酸乙酯,菠
3、菜叶。 四、实验流程五、操作步骤 1、菠菜色素的提取 称取2g洗净后的新鲜(或冷冻)的菠菜叶,用剪刀剪碎并与10mL甲醇拌匀,在研钵中研磨约5min然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁,弃去滤渣。 将菠菜汁放回研钵,每次用10mL 3:2(体积比)的石油醚-甲醇混合液萃取两次,每次需加以研磨并且抽滤。合并深绿色萃取液,转入分液漏斗,每次用5mL水洗涤两次,以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡,以防止产生乳化。弃去水-甲醇层,石油醚层用无水硫酸钠干燥后滤入圆底烧瓶,在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL为止。 2、薄层层析 取四块显微载玻片,用硅胶G加0.5%羧甲基纤维素调制后制板,晾干后在110活化1
4、h。 展开剂:(a)石油醚-丙酮=8:2(体积比) (b)石油醚-乙酸乙酯=6:4(体积比) 取活化后的层析板,点样后,小心放入预先加入选定展开剂的广口瓶内,盖好瓶盖。待展开剂上升至规定高度时,取出层析板,在空气中晾干,用铅笔做出标记,并进行测量,分别计算出Rf值。 分别用展开剂a和b展开,比较不同展开剂系统的展开效果。观察斑点在板上的位置并排列出胡萝卜素、叶绿素和叶黄素的Rf值的大小次序。注意更换展开剂时,须干燥层析瓶。 3、柱层析 在层析柱中,加3cm高的石油醚。另取少量脱脂棉,先在小烧杯用石油醚浸湿,挤压以驱除气泡,然后放在层析柱底部,轻轻压紧,塞住底部。将3g层析用的中性氧化铝(150
5、160目),从玻璃漏斗中缓缓加入,小心打开柱下活塞,保持石油醚高度不变,流下的氧化铝在柱子中堆积。必要时用橡皮锤轻轻在层析柱的周围敲击,使吸附剂装得均匀致密。柱中溶剂面由下端活塞控制,既不能满溢,更不能干涸。装完后,上面再加一片圆形滤纸,打开下端活塞,放出溶剂,直到氧化铝表面溶剂剩下12mm高时关上活塞(注意!在任何情况下,氧化铝表面不得露出液面)。 将上述菠菜色素的浓缩液,用滴管小心地加到层析柱顶部,加完后,打开下端活塞,让液面下降到柱面以上1mm左右,关闭活塞,加数滴石油醚,打开活塞,使液面下降,经几次反复,使色素全部进入柱体。 待色素全部进入柱体后,在柱顶小心加洗脱剂石油醚-丙酮溶液9:1(体积比)。打开活塞,让洗脱剂逐滴放出,层析即开始进行,用锥形瓶收集。当第一个有色成分即将滴出时,取另一锥形瓶收集,得橙黄色溶液,它就是胡萝卜素。 用石油醚-丙酮7:3(体积比)作洗脱剂,分出第二个黄色带,它是叶黄素(1)。再用丁醇-乙醇-水3:1:1(体积比)洗脱叶绿素a(蓝绿色)和叶绿素b(黄绿色)。 六、注释 (1)叶黄素易溶于醇而在石油醚中
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