免疫转印技术(副本).ppt

1、免疫转印技术,一、介绍 免疫转印（immunoblotting）技术又称蛋 白质印迹或Western blot，是一种将蛋白凝胶电泳、膜转移电泳与抗原反应相结合的新型免疫分析技术,Western blot,二、原理 蛋白质(病毒、细菌蛋白)经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），根据相对分子量的大小分成区带，然后通过转移电泳将SDS-PAGE上的蛋白质转印到硝酸纤维滤膜上加上相应的标记抗体（如酶标抗体、胶体金标记抗体、荧光抗体、放射性同位素标记抗体），也可先加抗体反应，再加标记的抗抗体，通过对抗体的标记物的检测，以分析特异性抗原蛋白区带。,Western blot,三、基本步骤 （一

2、）目的蛋白的分离 1、经过纯化的目的蛋白直接进入下一步 2、未经过纯化的目的蛋白需进行分离 a、SDS-PAGE（根据相对分子量） b、等点聚焦电泳（根据pI）,Western blot,（二）转印 转印就是将蛋白质由SDS凝胶上转移到固相支持物上。首选的固相支撑物是硝酸纤维滤膜（NC膜）,Western blot,1、半干电转印法：将凝胶和固相基质以三 明治样夹在缓冲液浸润的滤纸中，电转印10-30min 2、湿法电转印法：将凝胶和固相基质夹在 滤纸中间浸在转印装置的缓冲液中，通电转印45min或过夜,Western blotting,（三）免疫检测 1、NC膜的封闭 为防止NC膜的非特异性

3、背景着色，用封闭液对NC膜进行封闭。常用的封闭液为加有脱脂奶粉、小牛血清或牛血清白蛋白的缓冲液。,Western blotting,2、靶蛋白与特异性抗体（一抗）反应 将可识别靶蛋白的McAb或PcAb与NC膜一同温育。 3、靶蛋白与标记的二抗反应 待上步反应结束后，洗涤NC膜，使之与标记的二抗反应，二抗可用放射性同位素、酶、生物素、胶体金等标记。,Western blot,4、指示反应 根据标记物的不同，可采用放射自显影、底物显色等，在NC膜上显示相应的检测蛋白带,Western blot,四、Western blot 中应该注意的问题 （一）首先应该确定检测蛋白经SDS和还原剂处理后，其抗

4、原决定簇仍然可与相应的抗体结合。特别是在用单克隆抗体作为第1抗体时应考虑这一点。,Western blot,（二）要保证检测所用抗体的特异性，尤其是一抗的特异性更为重要。另外，对一抗和标记体的使用浓度，通常要根据实际情况作适当的调整。,Western blot,（三）实验操作过程中，拿取凝胶、滤纸和NC膜的时候，必须戴手套，因为皮肤上的油脂和分泌物会阻止蛋白质从凝胶转移到滤膜上。,Western blot,（四）转印时要注意电流的大小，过高的电流产生的热量会在凝胶和NC膜之间形成气泡，从而导致转印的失败。有报道，在转印缓冲液中加入20%的甲醇，虽然降低蛋白质的洗脱效率，但可以提高其与硝酸纤维素结合的能力。或者可以在缓冲液中加入终质量分数为0.1%的SDS,也可以提高转印效率。,Western blot,五、应用 免疫转印技术是蛋白质组分分析和蛋白多肽相对分子质量分析的主要方