第30章+DNA的复制、修复和重组扬州大学《生物化学》课件.ppt

1、,第34章 DNA的复制与损伤修复,为什么子女与父母非常相象？,生物所以有遗传现象，是与遗传物质DNA的复制有关系的。,1964-1970 发现劳氏肉瘤病毒的遗传信息传递方式：逆转录,1953年，Watson和Crick提出中心法则：遗传信息的单向流动。,中心法则：,RNA的复制存在于RNA病毒,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA,然后翻译成特异的蛋白质，以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。,复制：以亲代DNA或R

2、NA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。,几个基本概念：,逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。,转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。,中心法则图示,DNA的复制,DNA的存在形式 染色体与质粒,严紧控制质粒,又叫单拷贝质粒：每个细胞内只有一个或少数几个拷贝,松弛控制质粒,又叫多拷贝质粒：每个细胞内含有许多拷贝（20以上）,DNA复制 是指DNA的

3、自我复制，也就是以亲代DNA为模板产生子代DNA的过程，最初称DNA的半保留复制（semiconservation replication），进一步的研究发现半保留复制为半不连续复制（semidiscontinuous replication）。,一、DNA的半保留复制,2.半保留复制的实验证据:,1.定义：,1958年Meselson和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA,首先证明了DNA的半保留复制。,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合

4、成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,DNA复制的可能方式,全保留与全新复制,分散复制,半保留复制,半保留复制的证明：,Meselson 和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制。,15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度,DNA的半保留复制的生物学意义：,DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质。在各种因素作用下，DNA会

5、发生损伤，需要修复。,DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，是保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代必要措施。,（二）DNA复制的起点(origin)和方式,复制子(replicon)：基因组能独立进行复制的单位叫复制子，每个复制子都含有控制复制起始的origin和终止复制的终点（terminus）。,双向复制(bi-directional replication)、单向复制(unidirectional replication)； 复制叉(replication fork)或生长点(growing point) 多复制子(multi-replicon),双向复制,单向复制,二、DNA复制

6、的起点与方向,复制中的DNA,复制原点,复制叉,DNA复制的主要方式,大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点，双向复制）（细菌DNA复制叉移动速度50kb/min，大肠杆菌染色体完成复制需要40分钟，然而，大肠杆菌每20分钟即可分裂一次。如何解释？),真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起点，双向复制）复制叉移动速度为1kb3kb/min，高等真核生物一般复制单位长度为100200kb，每个复制单位在3060分钟完成复制，通常完成整个染色体复制的时间要用68h。,一轮复制尚未完成，又启动新一轮的复制。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距

7、离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,不同位置D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA：两条链的复制起点不同位置，且复制不同步）,单向滚环式复制（噬菌体X174DNA单链环状）,三、半不连续复制 （semidiscontinuous replication） 1、 体内仅存在5 3的DNA聚合酶 2、 前导链与随从链（岗崎片段）,前导链,滞后链,冈崎片段,前导链：DNA复制时，一股以3 5方向的母链作为模板，新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。,滞后链：DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，新合成链沿5 3合成1000-2000个核苷酸不连续

8、的小片段称为随从链。,复制方向与解链方向一致,复制方向与解链方向相反,冈崎片段,DNA半不连续复制： 3 5方向母链为模板，新链5 3方向连续合成5 3方向母链为模板，新链5 3方向合成许多不连续的片段（岗崎片段） 这种复制方式称之为半不连续复制。,RNA引物,DNA聚合酶 不能催化两个游离dNTP在DNA模板上聚合 需要具3-OH的引物,RNA聚合酶 能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合 提供3-OH 引物最后被DNA聚合酶除去、补满，再由连接酶连接,减少突变，提高DNA复制的真实性,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,RNA引物,3-OH,复制的真实性 严格的碱基配

9、对规律 RNA引物 聚合酶的选择作用 复制时有即时的校读功能 3 5外切酶功能 DNA损伤的修复机制,四、与DNA复制有关的酶和蛋白质,原料：四种脱氧核苷三磷酸 （dATP、dGTP dCTP dTTP) 需要模板：以DNA为模板链，合成子代DNA，模板可以是双链，也可以是单链DNA。合成产物与模板互补。 需要引物：一小段RNA(或DNA）为引物，在大肠杆 菌中，DNA的合成需要一段RNA链作为引物，引物含 3 -OH. 合成方向：5 3 ,(一) DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶，其后发现该酶在许多生物中广泛存在。该酶的催化性质如下：,（二）大肠杆菌

10、DNA聚合酶,（1）5 3 聚合酶功能（但持续合成DNA的能力差）； （2）3 5外切酶活性（对双链无作用，具有校对功能。）； （3）还具有5 3外切酶活性（双链有效）；,1、DNA聚合酶:1956年Kornberg首先从大肠杆菌中分离。该酶为单体酶,含一个锌原子。为多功能酶，具有:,该酶缺失时大肠杆菌仍具有DNA合成酶活性，只是对DNA损伤的修复能力下降，容易导致变异和死亡。推测该酶主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其缺口的填补。,3 5 5 3 外切酶 聚合酶,N,C,5 3 外切酶,小片段,大片段（ klenow片段）,切除RNA引物 损伤修复,校读功能,（常用

11、的工具酶）,1、DNA聚合酶,聚合功能,DNA聚合酶的功能,Arthur Kornberg 1918,Stanford University Stanford, CA, USA,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959,for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid,2、DNA聚合酶：,多亚基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶高；持续合成DNA的能力差。该酶缺失时大肠

12、杆菌仍具有DNA合成能力，推测该酶仍然不是真正的DNA聚合酶。该酶具有3 5外切酶活性。其功能可能在修复紫外光引起的DNA损伤中起作用。,3、DNA聚合酶,多亚基酶，含十种亚基:（），其中（）称为核心酶，2称为夹子，（2）组成复合物，其主要功能是帮助亚基夹住DNA，故称为夹子装配器，该酶DNA合成的持续能力强，主要与该结构有关。另外，该酶合成速度大，活性高，缺失时大肠杆菌因DNA复制抑制而致死。因此认为该酶DNA的真正复制酶。,DNA聚合酶全酶的亚基组成,DNA聚合酶的异二聚体,前导链的合成,滞后链的合成,DNA聚合酶的-钳子俯视图,DNA双螺旋,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,(三）DNA连接

13、酶：连接DNA双链中的单链切口,作用特点：,大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能连接双链DNA上的粘性切口，而且能连接无粘性末端的平头双链DNA。,DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。,DNA连接酶作用机理,(四)与DNA合成有关的其它蛋白因子(大肠杆菌中),1、拓扑异构酶,拓扑异构酶：催化DNA的拓扑连环数发生变化的酶，在DNA重组修复和其它转变方面起重要作用。 除连环数不同外其它性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体，引起拓扑异构体反应的酶称为拓扑异构酶。,拓扑异构酶：使DNA

14、一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。,拓扑异构酶：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。,两类拓扑异构酶作用特点:,二者共同控制DNA的拓扑结构。,2、解螺旋酶 （解链酶）,通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。,稳定DNA解开的单链，防止复性和保护单链部分不被核酸酶水解。,3、单链结合蛋白：,引发体可以沿模板链5 3方向移动,具有识别合成起始位点的功能，移动到一定位置上即可引发RNA引物的

15、合成。移动和引发均需要ATP提供能量， n蛋白具有ATP酶的活力。引发体的移动与复制叉移动的方向相同，与冈崎片段的合成方向相反。,3、引物合成酶与引发前体,引物合成酶：催化引物RNA的生成,引发前体:它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n、n和i组成。引发前体再与引发酶结合组装成引发体。,（五）、参与DNA复制的酶与蛋白因子总览图,五、 DNA的复制过程：（以大肠杆菌为例）,复制的终止：,复制的起始 1、起始复合物的形成：称为引发 2、RNA引物的合成,链的延伸：,复制原点oriC和原点的识别：,从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子（基因组独立进行复制的单位）。,DNA的复

16、制有特定的起始位点，叫做复制原点。常用ori C(或o）表示。大肠杆菌的复制原点ori C由245个bp构成，含两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也都是富含A、T的区段。,复制原点由DnaA蛋白识别， 在原点由DnaB蛋白（解螺旋酶）将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板，合成其互补链(DNA双链的解开还需DNA拓扑异构酶 、 SSB),在原点处形成一个眼状结构，叫复制眼。,（一）复制起始,1、拓扑异构酶解开超螺旋。 2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。 3、在类组蛋白HU、ATP参与下， Dan A蛋白

17、变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。 4 、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5 3 方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。 5、单链结合蛋白结合于单链。 6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。,(二) 链的延长（冈崎片段的合成）,真核生物的冈崎片段为：100-200bp 原核生物的冈崎片段为：1000-2000bp,DNA链的延伸,在DNA聚合酶的催化下，以四种5 -脱氧核苷三磷酸为底物，在RNA引物的3端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。,冈崎片段引物的切除、缺口的填

18、补和切口的连接:,前导链和滞后链的合成（DNA聚合酶的异二聚体催化）,(三) 复制的终止,顺时针终止陷阱,逆时针终止陷阱,Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp的序列，终止利用物质Tus可识别并结合，从而导致DNA复制的终止。,大肠杆菌DNA复制的终止,(四) DNA复制的精确性（高保真复制）,1、碱基的配对规律：摸板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/1041/105。 2、DNA聚合酶的35外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低1001000倍。 3、DNA的损伤修复系统。,DNA复制必须具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/1091/1

19、010，即每1091010个核苷酸才出现一个错误，也就是大肠杆菌染色体DNA复制100010000次才出现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：,六、真核生物DNA复制的特点,4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；采用更多的复制起点。,1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。,2、冈崎片段长约200bp。,3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为10003000bp/min(仅为原核生物的1/201/50）。,真核DNA复制特点,7、RP-A：真核生物的单链结合蛋白；

20、RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶填补缺口。,5、真核生物有多种DNA聚合酶,DNA聚合酶a/ DNA聚合酶是真正的复制酶，PCNA是b夹子。,6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶.,真核细胞内有五种DNA聚合酶,真核细胞端粒DNA的复制,1.端粒(telomere) 真核生物的线性染色体DNA 每复制一次，子链5有缺失 末端有特殊序列-端粒 特征: 由数百个串联重复的6核苷酸组成 人:

21、5-AGGGTTAGGGTT-3 端粒能稳定染色体,1978年首次发现四膜虫端粒的分子组成：,端粒 染色体DNA 端粒,人端粒的分子组成：,线形DNA复制末端问题,3,5,5,3,RNA引物水解,端粒 染色体DNA 端粒,2.端粒酶（telomerase) 组成 蛋白质(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板) 唯一携带RNA模板的逆转录酶 人端粒酶: 模板(RNA-端粒酶):3-CAAUCCCAAUC-5 合成(DNA): 5-AGGGTT-3 端粒酶和衰老、肿瘤有关,3、端粒酶的作用机制,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,TTGG

22、GGTTGGGGTTGGGG,2.聚合,1. 结合,3.移位,爬行模式,端粒酶的功能,TTGGGG,TTGGGG,端粒酶与细胞存亡,端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、细胞分裂导致的DNA缩短，使得染色体DNA完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。,正常细胞：,细胞分裂,细胞分裂,衰老死亡,细胞年轻化,抗衰老,染色体DNA,端粒,端粒,四、DNA的损伤与修复 DNA修复的基础： 一条链有损伤 修复酶切除 以未损伤的链为模板 合成原来相同的序列,（一）造成损伤的原因,自发因素 物理因素 化学因素,紫外线损伤（共轭双键） 电离辐射损伤（X线/线） 亚硝酸盐 C U 5-溴尿嘧啶 5-BU A

23、 氮芥类 烷化剂 羟胺 C- A,G,G,羟胺,DNA自发损伤 DNA复制时碱基的错误配对 罕见态碱基引起T-G、A-C错配,环出效应引起碱基错配,新合成链 TGGC TGGCA TGGCAATG 模板链 ACCGATAG ACCGTAG ACCGATAG,A,l l l l l l l l l l l l l l l l l,环出效应引起碱基缺失或插入 新合成链 TTTT TTTT TTTTGAC 模板链 AAAAACTG AAAACTG AAAACTG,l l l l l l l l l l l l l l l,A,A,新合成链 TTTT TTT TTTTTGAC 模板链 AAAAACTG

24、 AAAACTG AAAAACTG,T,T,l l l l l l l l l l l l l l l,羟胺（hydroxylamine，HA） 使C的化学成分发生改变，不能与G配对，而与A互补。经两次复制后，C-G对变换成T-A对。,（二）修复机制,光修复 （低等生物） 不需光复活酶 需光复活酶,（photoreactivation repair） 嘧啶单体 嘧啶二聚体 嘧啶单体 嘧啶二聚体 光复活酶（+） 蓝光,280nm,239nm,1、直接修复,光复活/光修复 光复活酶识别TT 与之形成复合物 吸收光能 使TT解开成为单体 酶从复合物中释放 仅作用于UV形成的产物,O6甲基鸟嘌呤直接被

25、修复,2、切除修复（excision repair） （1） UV特异核酸内切酶切除 DNA聚合酶填补、修复 DNA连接酶连接 （2） 人体重要的修复方式 ，对多种损伤均能起修复作用。 （3）缺乏UV特异核酸内切酶 着色性干皮病,切除修复发生在复制之前,核苷酸切除修复,dUTP酶可以分解dUTP为dUDP和dUMP 胞嘧啶C自发脱氨氧化生成尿嘧啶U 尿嘧啶-N-糖苷酶,腺嘌呤脱氨成次黄嘌呤 次黄嘌呤-N-糖苷酶 烷基化修饰的碱基被糖苷酶除去,AP位点（apurinic/apyrimidinic site）无嘌呤或无嘧啶位点,碱基切除修复,DNA糖苷酶识别切除改变的碱基 核酸内切酶切除磷酸二酯键

26、 DNA聚合酶填补 DNA连接酶连接,DNA糖苷酶具特异性 识别-DNA中的异常碱基 水解-异常碱基与脱氧核糖间糖苷键 使其脱落,DNA碱基的组成为何是“T” ？ （1）DNA中的C容易突变成U （2）尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U （3）若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U DNA中T的存在增加遗传信息的稳定性 RNA中的U：数量多/半衰期短/经济,碱基切除修复,DNA损伤,核苷酸切除修复,3、错配修复 耗能的过程,DNA错配修复的模型,4、重组修复（recombinational repair）,二聚体后起始途径复制继续 子链缺口经重组由母链相应片段填补 RecA 蛋白具有交换DN

27、A链活力 母链缺口再合成 二聚体可被切除修复，如未被去除，将随多次重组修复而逐渐稀释。,复制后修复,5、易错修复,细胞DNA受到严重损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，能引起一系列复杂的诱导效应SOS反应。 SOS反应诱导的修复系统包括： 避免差错的修复(如切除修复和重组修复） 易错修复（诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶）,SOS反应诱导缺乏校对功能的DNApol、 引起校对系统的松懈 RecA基因产物 LexA蛋白自身水解（蛋白酶活性被激活） SOS系统开放：修复系统的酶表达,LexA基因表达也增加使SOS反应可迅速逆转,SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。SOS反应造成大量的突变体。因此，SOS可能在生物进化中起重要的作用。,大多数在细菌中诱导产生SOS反应的作用剂，对高等生物都是致癌的，因此，目前有关致癌物的一些简便的检测方法即是根据SOS反应原理设计而设计的。,五、DNA突变（一）突变的类型,点突变 类型 结果,转换-同型碱基 颠换-异型碱基 启动子/剪接信号 影响整