液相色谱基础009210.ppt

1、液相色谱基础知识，杨丹报道：09.09.21，我们实验室的高效液相色谱，碳酸钙(固定相)，色素混合物，石油醚(流动相)，1906年，俄罗斯植物学家茨维特发现了植物色素分离现象，色谱柱，1。色谱的起源，液相色谱的基础知识，定义不同的物质在两相中有不同的分配系数(或吸附系数和渗透率)。当两相相对运动时，这些物质会重复分布在两相中，实现分离。固定相可以装在柱中或制成薄层。前者称为柱色谱，后者称为薄层色谱。液相色谱：以液体为流动相的色谱分离方法，适用于高沸点、高分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析。流动相具有携带样品分子和选择性分离的双重功能。以气体为流动相的色谱分离方法适用于低沸点、热稳定性好的中

2、小分子化合物的分析。流动相只能携带样品分子。液相色谱基础知识、液相色谱基础知识、反相液相色谱基础知识、流动相极性大于固定相且可溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物、不溶于水/有机混合物的亲脂性样品和异构体混合物以及制备高效液相色谱的基础知识、液相色谱基础知识、采用“高效液相色谱”级溶剂以避免使用会导致柱效损失或保留特性变化的溶剂，并对样品具有合适的溶解度。溶剂粘度应小，以匹配检测器、流动相的选择、溶剂的等级、水的等级、纯净水、蒸馏水、去离子水、波长(nm)、纯净水、去离子水，由于杂质的存在，去离子水的吸光度较高。纯净水去除了无机和有机污染物，吸光度，水/甲醇梯度消耗臭氧层物质柱，鬼峰，梯度曲

3、线，1毫升/分钟，0-100%甲醇超过10分钟，保持15分钟。溶剂等级、鬼峰外观、溶剂等级等。溶剂等级为高效液相色谱等级、高级别和纯分析纯度，所有溶剂均用0.45u蒸馏过滤(除纤维毛和未溶解的机械颗粒外，高级别的纯度大于分析纯度，但它含有防腐剂和抗氧化剂，高效液相色谱等级用0.2u过滤，具有紫外吸收的杂质去除，微量分析，梯度洗脱，甲醇乙腈-己烷，分析纯级(实线)和高效液相色谱等级溶剂(虚线)之间的吸光度比较，溶剂等级，一般维护和故障排除，使用缓冲液，使用前过滤，使用后清洗色谱柱。为避免腐蚀、磨损和堵塞，先用纯水冲洗10-30分钟(0.5-1毫升/分钟)，然后用甲醇冲洗30分钟(0.1-0.5毫

4、升/分钟)，易受细菌和霉菌影响。溶解剂的等级相同。注意冲洗顺序，不能直接用有机溶剂冲洗。过滤：0.45um或更小孔径的滤膜目的：去除避免堵塞色谱柱，特别是当使用无机盐制备的缓冲液时，过滤和脱气：去除流动相中相互溶解或混合产生的气泡对测定的影响：1)泵中的气泡使液体流量波动，改变保留时间和峰面积；2)柱内气泡使流动相四处流动，峰变形；3)检测器中的气泡在没有在线脱气的情况下产生基线波动。混合溶剂的脱气时间不宜过长，溶液应先处理，液相色谱基础知识，梯度洗脱形式：线性梯度：在梯度洗脱过程中，流动相强度的变化与时间成线性比例。指数梯度：梯度洗脱过程中，流动相强度随时间的变化呈指数关系。梯度洗脱过程中，

5、流动相强度随时间的变化呈跳跃关系。梯度洗脱装置：高压梯度：高压泵对不同的流动相加压，送至梯度混合室进行混合。低压梯度：在常压下混合两种溶剂(或多种溶剂)，然后用高压注射泵将流动相泵入色谱柱。梯度洗脱形式的选择，液相色谱基础知识，梯度洗脱：优点：可以提高分辨率，缩短分离时间，减少最小检测量，提高分离精度，提高检测器的灵敏度。注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差，梯度混合的溶剂混溶性更好。梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器(如紫外吸收检测器或荧光检测器)。然而，不可能使用对流动相的组成变化敏感的通用检测器(例如差示折射率检测器)。选择溶剂时，应注意以下原则：-减少溶剂峰

6、，尤其是不使用组分峰接近溶剂峰的流动相-确保样品在流动相中的溶解度。避免样品在系统中沉淀，尤其是在色谱柱中。2.如果样品很脏，使用0.45微米的滤膜进行过滤。样品分选、进样器、自动进样器(SIL-10A/SIL-10Ai/SIL-10ADvp)手动进样器原理：(六通阀)进样方法：1)全进样2)液相色谱基础知识、手动进样器示意图、进样状态、液相色谱基础知识、进样状态、交叉污染原因、微量进样器、红色表示残留样品、手动进样方法、常用方法1。在注射状态2下清洁针头接口。在填充状态3下插入微量注射器。注入样品4。切换到注射状态，手动注射方式，便捷方式1。在注射状态2下插入微量注射器。切割至填充状态3。注

7、入样品4。回到进样状态，柱温箱，提高柱效率，降低柱压，确保检测稳定性。液相色谱基础知识，柱压低于150 kgf/cm2，柱温约40，最大使用温度为50，缓冲液酸碱度范围为27，消耗臭氧层物质柱使用注意事项：当酸碱度为34时，硅胶稳定性最好。液相色谱基础知识，液相色谱基础知识，色谱柱的类型和应用范围，分析柱的维护，在使用新的色谱柱之前，最好用强溶剂如甲醇以低流速(0.2-0.3毫升/分钟)洗涤30分钟，长期未使用的分析柱也应同样处理。用有机溶剂4冲洗，净化样品5，分离条件6，不使用时，盖上盖子以防止固定相干燥。常用的检测器，紫外检测器(包括二极管阵列检测器)，荧光检测器，微分折射率检测器，电导检

8、测器，蒸发式激光散射检测器，液相色谱基础知识，原理：基于定量基础的选择性吸收特定波长紫外光的分析成分：比尔定律，AKCL的优点：1)高灵敏度；2)对温度和流速不敏感；3)梯度洗脱的缺点：仅适用于紫外吸收物质的测定，紫外检测器，二极管阵列检测器，二极管阵列检测器(SPDM10AVP)-21世纪标准紫外检测器的色谱定性基础：保留时间常规紫外检测器峰纯度二极管阵列检测器，液相色谱基础知识，样品池，二极管阵列，光栅，D2/瓦灯，每种成分可以得到每种波长的吸光度值，二极管阵列检测器， 1)收集三维光谱2)检查峰纯度3)搜索光谱库4)当发现单波长检测时，原理：基于被分析成分发出的荧光强度的检测具有优点：1

9、)极高的灵敏度，是最灵敏的检测器之一； 2)良好的选择性；3)对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。缺点：它只适用于能产生荧光的物质的测定。可检测物质：多环芳烃、真菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚胺等。(用对称共轭系统)，荧光检测器，原理：优点：通用检测器的缺点：1)对温度变化敏感；2)对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度洗脱；3)中灵敏度检测器、微分折射率检测器、液相色谱基础知识、蒸发激光散射检测器原理；色谱柱后的流出液在到达检测器的途中被高速氮气喷成雾滴，溶质形成不挥发的微小颗粒，由载气带入检测系统。进入散射室，检查散射光的强度。Advantage :消除了温度变化引起的溶剂干扰和基线漂移。梯度洗脱，灵敏度高。高效液相色谱