第二单元 原料预处理技术.ppt

1、、第二单元原料预处理技术、Company Logo、学习目标、1 .发酵液预处理的目的和主要方法及其原理。 2 .常用的细胞破碎方法和原理。 3 .生物分离中常用的离心过滤方法。 Company Logo，第一节概括了微生物发酵和动植物细胞培养结束后，发酵液(或培养液)中除了存在必要的生物活性物质以外，还存在大量菌体、细胞、细胞内外代谢产物及其馀培养基成分等。 Company Logo，通常的处理方法是将菌体、细胞、固体培养基等固体悬浮粒子和可溶性成分分离(即固液分离)，然后进行后续的分离纯化操作单元。 对于细胞内生成物，应该在经过细胞破碎使生物活性物质转变为液相之后，通过固液分离去除细胞碎片

2、等固体杂质。 Company Logo，常用的固液分离方法主要是过滤和离心。 但是，不同来源的培养液和发酵液固液分离速度差异很大，根据该介质的理化性状，主要是细胞或菌体的大小和介质的粘度。 细胞凝集技术是近年来迅速发展的有效方法。 Company Logo、发酵液中杂质多，对后续分离影响最大的是昂贵的无机离子(Ca2、Mg2、Fe3)和杂蛋白等。 预处理时，请尽量把这些物质拿出来。Company Logo，第二节前处理的目的和方法，一、前处理的目的是改变发酵液的物性，促进从悬浮液中分离固体物质的速度，提高固液分离器的效率。 尽量将生成物转移到容易后处理的某一相(多为液相)。 去除发酵液中杂质的

3、一部分，使之后的各工序的操作变得容易。公司记录、二、预处理方法、1、加热方法的关键在于产品的热稳定性。 是最简单廉价的预处理方法，加热可以降低悬浮液的强度，加速凝聚作用，去除某些蛋白质杂质，破坏凝胶状结构，增加蛋糕的孔隙率，使固液分离变得容易。 Company Logo，2 .调节悬浮液pH值的方法也很简便。 全细胞的凝集作用取决于pH值的大小，适当的pH促进凝集作用，一般由草酸、无机酸或碱来调节。 Company Logo，3 .凝聚和凝聚是悬浮液预处理的重要方法。 均将化学药品投入悬浮液中，改变细胞、菌体、蛋白质等胶体粒子的分散状态，损害其稳定性，收集到可分离的絮凝物中进行分离。 Comp

4、any Logo、凝聚和凝聚可有效增加颗粒大小，增加颗粒沉降或浮选速度，提高滤饼的渗透性，或在深层过滤时产生良好的颗粒保留作用。 深层过滤：虽然粒子尺寸比介质的细孔直径小得多，但是细孔弯曲细长，粒子进入后容易被阻断，通过流体流动时引起的压迫和冲击作用，粒子附着在细孔的壁面上，这种过滤在介质内部进行，介质表面没有形成蛋糕。 Company Logo、凝聚和凝聚：投入的化学物质(如水解的凝聚剂、铝、铁的盐类和石灰等)使胶体脱稳定，使粒子之间凝聚成1mm大小的块状凝聚体的过程。 絮凝剂的作用：中和粒子表面电荷； 去除双电层，以脱稳定的氢键或其他复杂的形式与粒子结合凝聚。 Company Logo，凝

5、聚和凝聚：使用凝聚剂(通常是天然或合成的大分子质量电解质)将胶体粒子交联在网络上，形成10mm大小的凝聚团的过程。 絮凝剂的作用：架桥作用。 您可以选择进行集聚过程、凝聚过程、凝聚过程、凝聚过程、凝聚过程、凝聚过程。 最佳凝聚剂使用量是粒子表面的约一半被聚合物复盖时使用的凝聚剂使用量。 Company Logo，凝聚剂和凝聚剂的类型，凝聚剂：主要是无机系电解质，多为阳离子型，有无机盐类、金属氢氧化物类和聚合无机盐类等。凝聚剂：其官能团分为阴离子、阳离子、非离子3种。 Company Logo，4 .去除杂蛋白的其他方法，等电沉淀法蛋白在等电点溶解度最小，可以去除沉淀。 多数蛋白质的等电点在酸性

6、范围内(pH为4.0-5.5 )。 有些蛋白质在等电点也有溶解度，可与其他方法结合。 Company Logo将改性沉淀蛋白质从规则序列变化为不规则结构的过程称为改性，改性蛋白质在水中的溶解度小，产生沉淀。 方法：加热、pH大幅度改变、有机溶剂(丙酮、乙醇等)、加权金属离子(Ag、Cu2、Pb2等)、有机酸(三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、单宁酸、高氯酸等)及表面、Company Logo、吸附作用始终为杂蛋白发酵液中加入反应剂后，它们相互反应生成的沉淀物对蛋白质有吸附作用而凝固。 Company Logo，5 .去除不溶性多糖，多不溶性多糖时，发酵液粘度增大，固液分离困难，用酶转化为单糖，提高过滤

7、速度。 蛋白质组学发酵液中加入淀粉酶，可将培养基中多才淀粉水解为单糖，降低发酵液的粘度，提高滤速。 Company Logo，6 .除去昂贵的金属离子，影响产品质量的无机杂质主要是Ca2、Mg2、Fe3等昂贵的金属离子，在预处理中应该除去它们。 Company Logo，1，概念细胞破碎是一种以物理、化学、酶和机械方式破坏细胞壁和细胞膜的方法。 所谓细胞破碎技术，就是利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物释放出含有目标物的成分的技术。 2 .目的破坏细胞周边，释放细胞内容物。 第三节细胞破碎技术，Company Logo，3 .原理细胞结构细胞壁的破碎最为重要。 动物细胞没有细胞壁，容易破碎

8、。 植物和微生物细胞的细胞壁坚固，破碎困难。Company Logo、细菌革兰阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层构成，细胞壁厚为15-50nm。 革兰氏阴性菌的细胞壁在肽聚糖的外侧有由脂蛋白、脂多糖和磷脂构成的2层外壁层，肽聚糖层为1.5-2nm，外壁层为8-10nm。 因此，革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，难以破碎。Company Logo，细胞壁的结构和组成，图3.1细胞外层结构，Company Logo，真菌和酵母细胞壁呈丝状，比革兰阳性菌的细胞壁厚，约60nm，更难破碎。 霉菌细胞壁较厚，100-250nm。 哺乳类细胞、嗜盐菌和支原体哺乳类细胞和嗜盐菌没有硬细胞壁，支原体没有细胞壁

9、，容易破碎。 Company Logo，藻类细胞壁复杂，其主要成分为纤维状多糖物质。Company Logo，细胞壁的结构和组成、各种微生物细胞壁的结构和组成、Company Logo，细胞破碎和产物释放原理、细胞破碎主要采用各种机械破碎法和化学破碎法，或者结合。 机械破碎中细胞受到的机械作用力主要有压缩力和剪切力。 化学破碎也称为化学渗透，利用化学和生化试剂(酶)改变细胞壁和细胞膜的结构，提高细胞内物质的溶解速度。 或者细胞壁完全溶解形成原生质体后，渗透压使细胞膜破裂释放细胞内物质。 Company Logo，破碎方法，细胞破碎机制，二，细胞破碎法，细胞破碎方法分类，Company Logo

10、，细胞壁破碎，破碎方法的选择：破碎目的破碎对象生物的类型破碎目的：取得产品，研究细胞内产物在体内的功能，考虑破碎产率和能耗破碎的生物类型：不同生物对破碎的灵敏度不同，Company Logo、细胞壁的破碎、细胞破碎的灵敏度、生物大小、形态、龄期、品种、生长条件、细胞壁结构、pH、温度和细胞的变化也影响破碎的灵敏度。Company Logo，1 .机械破碎方法，HC23-高压细胞破碎机，高压均质法，DY89-1型电动玻璃均质器，Company Logo，作用机理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座和阀门之间的环隙高速的高压均质器的操作高压均质法，Company Logo，1 .机械破碎方法，影响细胞破

11、碎的因素：温度压力循环操作次数细胞浓度阀座形式，高压均质法，Company Logo，影响破碎效率的因素，温度：破碎率随温度增加高温有利于破碎，但热改性压力适用于酵母和细菌细胞的破碎，高压均相法，Company Logo，1 .机械破碎方法，珠磨概略图，珠磨法，生产厂家：瑞士WAB公司德国西门子机械公司型号：立式(效率高)，Company Logo，原理：搅拌珠磨机法、Company Logo、珠磨机主体：一般为纵型和横型的圆筒型腔，横型的破碎效率比纵型珠磨机高：因为在纵型机中向上流动的液体在某种程度上使研磨珠流动化，使其研磨效率降低。 研磨珠：玻璃(密度2.5gcm3)或氧化锆(密度6.0

12、gcm3)微球(粒径约0.110mm )、填充率8085。 Company Logo，1 .机械破碎方法，动力学方程式：一次动力学方程式，珠磨法，R:t时间内能够释放的蛋白质的数量(mg/g) Rm :能够释放的蛋白质的最大数量，即100破碎k :遵循破碎速度常数的1 .机械破碎方法， 影响破碎效率的因素：转台外缘速度细胞浓度玻璃珠大小和装载量温度流速、玻璃珠磨法、Company Logo，1 .机械破碎方法、玻璃珠磨法破碎过程产生大量热能，修订时需要考虑热交换问题。 适用于大部分真菌菌丝和藻类等微生物细胞的破碎。 影响破碎率的操作残奥表很多，操作过程的优化设定很复杂。 珠磨法，Company

13、 Logo，1 .机械破碎方法，原理：细胞为弹性体，比一般的刚性固体粒子更难破碎。 使弹性细胞冻结成刚性球体，降低破碎难度的冲击破碎就是基于这样的原理。 操作：将细胞悬浮液高速冻结成喷雾状(冻结速度为每分数千度)，形成粒径小于50um的微粒子。 高速载气(例如氮气、气流约300m/s )将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击碰撞板，破碎冻结的细胞。 冲击破碎法，Company Logo，1 .机械破碎方法，特点：细胞破碎只发生在碰撞板的瞬间，细胞破碎是均匀的，可以避免因反复受力而过度破碎的现象。 细胞破碎的程度可以通过无级调节载气的压力(流速)来控制，避免细胞内部结构的破坏，主要用于细胞器(如线粒

14、体、叶绿体等)的回收。 冲击破碎适用于微生物细胞和植物细胞的破碎。 冲击破碎法，Company Logo，1 .机械破碎方法，JY92-型超声波细胞破碎机，超声波法，Company Logo，1 .机械破碎方法，作用机理：超声波对液体产生气蚀作用的超声波的细胞破碎效率与细胞的种类、浓度和超声波的声频、声能有关超声波法，Company Logo，1 .机械破碎方法，超声波的负面影响： 1，温度上升：悬浊液预冷，夹套冷却短期冷却和短期破碎交替。2 .超声波处理引起自由基那样的化学效果，破坏目标物，加入自由基去除剂(组氨酸、谷胱甘肽等)可以去除。 3 .影响因素：声强、声音、温度、时间、离子强度、p

15、H、细胞类型。 超声波法，Company Logo，1 .机械破碎方法，机械破碎细胞的优缺点：内容物总释放时间短，效率高，成本低通用性强，适合实验室和工业生产的缺点：需要高能量，产生高温、高剪切力， 产品变性不全2 .化学和生化渗透法(非机械法)，作用机理：用化学试剂溶解细胞壁或提取细胞中某些成分的处理方法：酸碱处理； 化学试剂表面活性剂； 有机溶剂EDTA螯合剂； 改性剂，化学渗透法，Company Logo，2 .化学和生化渗透法(非机械法)，酸碱处理调节pH，改变蛋白质的带电性，提高生成物的溶解度。 化学试剂处理可以用表面活性剂和有机溶剂(甲苯)处理细胞，增大细胞壁的渗透性，降低细胞内产

16、物的相互作用，使之容易释放。 Company Logo，2 .化学和生化渗透法(非机械法)，优点：产物释放有一定的选择性，不需要特殊设备细胞外形完整，细胞碎片少，浆液粘度低，有利于后续分离，化学渗透法，缺点：通用性差时间长2 .化学和生化渗透法(非机械法)， 应用：细胞内酶活性释放细胞内物质的检测研究，化学渗透法，Company Logo，2 .化学和生化渗透法(非机械法)，作用机理：酶溶解法(enzyyy溶菌酶适用于革兰阳性菌细胞壁的分解，应用于革兰阴性菌时，必须辅助EDTA使细胞壁更有效地作用真核细胞的细胞壁与原核细胞不同，需要使用不同的酶。 酵母细胞的酶溶解需要Zymo1yase (几种细菌酶的混合物)、- 1，6 -葡聚糖酶(或者甘露糖酶)，破坏植物细胞壁需要纤维素酶。 酶法细胞溶解，Company Logo，2 .化学和生化渗透法(非机械法)，优点：产品