生物化学与分子生物学八年制课件25.ppt

1、重组DNA技术 Recombinant DNA Technology,第二十四章,克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆(DNA cloning) 细胞克隆 器官（或组织）克隆 个体克隆（动物或植物）,重组DNA技术（recombinant DNA technology） 又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因克隆（gene cloning) 技术，是指在体外利用酶学方法将目的DNA片段与能

2、自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。 克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering）。因此，重组DNA技术又称为基因工程技术。,* 重组DNA技术的发展简史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 1972年 P. Berg 构建第一个重组DNA分子(猿猴病毒DNA和 噬菌体DNA) 1973年 S. Cohen首次将DNA片段与质粒连接，并转化入E.co

3、li 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工， 程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功地克隆了“多莉”羊,Mendel,Paul Berg,Ian Wilmut and “Dolly”,第 一 节 重组DNA技术中常用的 工具酶 Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology,限制性核酸内切酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 反转录酶 末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶） DNA聚合酶 DNA聚合酶I大片段 Taq

4、DNA聚合酶 多核苷酸激酶,工具酶在重组DNA技术中具有 特殊的用途,重组DNA技术中常用的工具酶,一、限制性核酸内切酶用于切割DNA,定义: 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性核酸内切酶是重组DNA技术中重要的工具酶。,+,Bam H,分类：根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类（基因工程技术中常用型） 型：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，需要Mg2+、ATPs-腺苷酰甲硫氨酸作为催化的辅因子，在DNA降解时伴随有ATP的水解。即

5、它具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。若识别位点上两条DNA链均未甲基化，则行使内切酶功能，并在切割DNA同时或之后转变为ATP酶；若位点上只有1条链被甲基化则发挥修饰功能，使另一条链也甲基化；若位点上两条链均甲基化就与位点解离。其显著特点是识别位点和切割部位不一致，无固定切割位点，一般在识别位点以外的1kb（不少于400bp）到几kb（可多达7kb）处随机切割，不产生特异片段，故在基因重组中没有应用价值。 型：与型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活力；不同的是它能在DNA链上的特异位点切割，其切割位点在识别位点以外，对基因工程的意义也不大。,限制酶

6、的作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA，犹似高等动物的免疫系统。,型：就是通常指的DNA限制性内切酶，在基因工程技术中常用。特点：分子量小，仅需Mg2+作为催化反应辅助因子，它们能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段。 类酶识别序列特点为回文结构，一般为46bps（有些为8或8个以上碱基序列） ，且富含GC。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体； 第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus

7、influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,（一）重组DNA技术中通常使用型限制酶,E=Escherichia，埃希氏菌属 co=coli，大肠杆菌菌种 R=RY13，菌株名 I=第一个被分离到的内切酶,命名,EcoR,（二）型限制性内切酶具有一些共性和特性,1. 具有特定的识别和切割位点,II型限制性内切酶的识别位点举例（示切割位点）,2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）,Bam H,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端,（sticky end）,（blunt end）,同尾酶（isocaudarner） 有些限制

8、性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,4. 不同的酶可以产生同样的末端,+,Bam H,+,Bst,+,Xma,+,Sma,能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶。,5. 不同的酶可以识别同一个序列,6. 切割会受其他因素的影响 限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。例如，EcoR I在正常情况下识别“-GAATTC-”序

9、列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性（star activity），以EcoR I*表示。,二、DNA连接酶用于催化DNA片段连接,DNA连接酶（DNA ligase）：催化两个相邻的3-OH和5-磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。,连接酶的作用机制,BamH I,1. 大肠杆菌染色体编码的 DNA连接酶 需NAD+作为辅因子 2. 大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的T4 DNA连接酶 需ATP作为辅因子,DNA连接酶的来源,三、重组DNA 技术中还需使用其他

10、常用工具酶,（一） 碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团 （二）反转录酶以RNA为模板合成cDNA （三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏性末端 （四）DNA聚合酶I主要用于合成DNA （五）DNA聚合酶I大片段保留了有用的酶活性 （六）Taq DNA聚合酶常用于PCR （七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化,来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸基团，使5 -P成为5 -OH，该过程称核酸

11、分子的脱磷酸作用。,（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团,（二）反转录酶以RNA为模板合成cDNA,反转录酶 （reverse transcriptase）,反转录酶催化的cDNA合成,RNA,RNA,5,3,AAAAAA,AAAAAA,TTTTTT,5,3,cDNA,cDNA,随机引物,Oligo-dT,5,3,5,5,3,3,5,3OH,GGG,GG,dGTP,末端转移酶,（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏端,大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中常用的DNA聚合酶。其除具有53聚合酶活性外，还有35及53核酸外切酶活性。因其具有

12、53核酸外切酶活性而常用于DNA探针的缺口平移法（nick translation）标记。,（四）DNA聚合酶I主要用于合成DNA,DNA聚合酶I大片段（large fragment of DNA polymerase I）为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。其保留了53聚合酶活性及3 5外切酶活性，失去了5 3外切酶活性。它具有的35外切酶活性能保证DNA复制的准确性，即把DNA合成过程中错配的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去（该活性称为校对活性）。 Klenow片段的主要用途有： 补

13、齐双链DNA的3末端，使其转变成平端；或通过补齐3端而使3末端标记； 在cDNA克隆中，用于第二股链的合成； 用于DNA序列分析。,（五）DNA聚合酶I大片段保留了有用的酶活性,将黏端转变成平端,G,C T T A A,OH 3,5,3,5,GA A T T,C T T A A,5,3,3,5,对5-黏端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3-OH端延伸，可填平末端的凹陷并将其转变成平端。,DNA聚合酶,EcoR,将黏端转变成平端,C T G C A,G,5,3,5,C,G,5,3,3,对3黏端的片段，应用如T4 DNA聚合酶的35的核酸外切酶活性可切去未配对的序列，将其转变

14、成平端。,核酸外切酶,Pst,5,3,（六）Taq DNA聚合酶常用于PCR,Taq DNA聚合酶具有良好的聚合活性和热稳定性，常用于PCR。该酶具有53聚合酶活性及53外切酶活性，但没有35外切酶活性，因而无35校对活性，故在PCR反应中如果发生碱基错配，该酶没有校正功能。针对此不足，目前研发出多种高保真耐高温DNA聚合酶，大大降低了PCR过程中的碱基错配率。 另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用，能在所合成DNA链的3末端加上一个单独的腺苷酸残基（A）。这样的PCR产物可直接与带有3-T的线性化载体（T载体）连接（即T-A克隆）。,（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化,

15、常用的是T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase），该酶含5多核苷酸激酶和3磷酸酶活性，能催化ATP的-位磷酸向DNA和RNA的5-羟基转移。 该酶常用于： DNA或RNA的5末端标记； 使没有5-末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供连接和克隆之用。,第二节 目的DNA的获取 Preparation of Interested DNA,一、化学合成法可直接合成目的DNA,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 应用：一般用于小分子肽类基因的合成,* 化学合成法获取目的DNA,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,色 苯丙 蛋 赖,第一步：构建基因组DNA文库（

16、是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息）。 第二步：筛选含有目的基因的克隆。,二、从基因组DNA文库中获取目的DNA,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶或机械剪切,受体菌,基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合,* 从基因组DNA文库获取目的基因,三、从cDNA文库中获取目的DNA 第一步：构建cDNA文库（包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存了全部

17、的基因表达信息）。 第二步：筛选含有目的cDNA的克隆。,cDNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有cDNA片段的集合,基因组DNA文库和cDNA文库的构建,从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选目的DNA的策略 1. 菌落或噬斑原位杂交 2. 针对表达文库，可用抗原-抗体或配体-受体结合的原理（亲和筛选法）筛选,*从基因组DNA文库获取目的基因,菌落原位杂交法等方法，可从文库中筛选含有目的基因的噬菌体,cDNA library,从cDNA文库获取目的基因,如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，可不必要经过复杂的DNA文库构建过

18、程。 PCR是一种高效快速的体外DNA聚合程序,四、经PCR获取目的DNA,PCR 体系,模板 引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs 含Mg2+的缓冲液,PCR的过程,变性(Denaturing): 经加热使模板DNA 从 dsDNA 变成ssDNA 退火(Annealing): 引物与模板DNA杂交 延伸(Extension): DNA 合成,ing,PCR的头三个循环,酵母单杂交系统,五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNA,A. 无转录因子：报告基因不表达,“诱饵”DNA序列,B. 有转录因子：报告基因表达,C. 有转录因子 AD/DNA结合蛋白融合蛋白：报告基因表达,转录因子的

19、AD,转录因子,DNA结合蛋白,.,报告基因,报告基因,酵母双杂交系统,B. 有相互作用的蛋白质，报告基因表达,启动子,A. 无相互作用的蛋白质，报告基因不表达,“诱饵”,“猎物”,AD,BD,上游激活序列,启动子,BD,“诱饵”,“猎物”,AD,上游激活序列,第三节 重组DNA技术中的DNA载体 DNA Vectors in Recombinant DNA Technology,载体（vector）是为携带感兴趣的外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子,按功能分,克隆载体（cloning vector）,表达载体（expression ve

20、ctor）,按基本元件的来源不同,质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等,载体概述,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录和翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,一、克隆载体用于外源DNA的克隆和无性繁殖,（一）克隆载体应具备的主要特点,至少有一个复制起点（origin of replication, ori） 至少有一个选择性标志（selection marker） 有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位点（multi

21、ple cloning sites，MCS） 应有较高的拷贝数。,pBR322质粒图谱,1. 质粒 (plasmid),特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。,（二） 常用克隆载体有多种,严紧型质粒:质粒与细菌染色体同步复制，处于严密控制之下，其拷贝数较低。 松弛型质粒:质粒的复制快于细菌染色体复制（即质粒复制不受严格控制），其拷贝数很高。重组DNA技术中使用的质粒通常是松弛型。 不同的质粒必须兼容才能共存于同一细胞中，这对复合转染（或转化）有参考价值。 目前，已有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，如pUC系列、pGEM系列等。 质粒载体通常所能容纳

22、的外源DNA长度在10 kb以内，外源DNA片段越长，质粒越不稳定。,pUC系列质粒图谱,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用于cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用于基因组DNA克隆） cos位点:噬菌体DNA为线性双链分子，两端各有一条由12个碱基组成、彼此完全互补且5单链突出的序列（即粘性末端），称cos位点,2. 噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列,3. 穿梭载体（shuttle vector）,人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。,表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体

23、 依据其宿主细胞的不同可分为: 原核表达载体（prokaryotic expression vector） 真核表达载体（eukaryotic expression vector）,二、表达载体用于外源DNA的表达,（一） 原核表达载体用于在原核细胞中表达外源基因 从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体的一般特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。目前应用最广泛的原核表达载体是大肠杆菌表达载体。原核表达载体的基本组成如下：,R：调节序列； P：启动子； SD：SD序列；TT：转录终止序列,大肠杆菌表达载体,Lac启动子（乳糖启动子） Trp启动

24、子（色氨酸启动子） Tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子） PL和PR启动子（噬菌体的左向和右向启动子） T7启动子,1. 启动子是启动外源基因表达的必需元件，其能被RNA聚合酶所识别：目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种,2. SD序列提供核糖体结合位点 mRNA在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位点（ribosome binding site）的存在。SD序列（Shine-Dalgarno sequence）位于转录起始位点上游813 bp处，为富含嘌呤的短片段，其能与核糖体30S小亚基中的16S rRNA 3端的部分序列互补结合。SD序列作为核糖体结合位点，保证了翻译起始复合物的形

25、成。,3. 转录终止序列有助于外源基因的高效表达 尽管载体中没有转录终止序列，也可表达某些外源蛋白，但表达效果通常不理想。因此，多数原核表达载体中都带有转录终止序列。 转录终止序列长短不一，短的只有几十bp，长的可达几百bp。 转录终止序列有助于使RNA聚合酶重点转录克隆的外源基因，控制所转录RNA的长度，提高RNA稳定性。 位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。,4. 几种常见的原核表达载体各有特点 依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为 （1）非融合型表达载体 （2）融合型表达载体 （3）

26、分泌型表达载体,（1）非融合型表达载体用于表达非融合蛋白 非融合蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起进行表达的蛋白。表达该类蛋白的载体称为非融合型表达载体。,使用强启动子tac，紧接tac启动子的是多克隆位点，目的基因克隆于启动子和SD序列下游。在多克隆位点下游包含一个很强的rrnB核糖体RNA的转录终止子，其作用是为了稳定载体系统，因为上游强的tac启动子控制的转录必须由强终止子抑制，才不至于干扰与载体本身稳定性有关的基因表达。载体的其余部分来自pBR322。 使用pKK223-3时，应配套使用LacIq宿主菌，在无IPTG诱导时，tac启动子受阻遏，当加入IPTG后，便可去阻遏，从而

27、使外源基因表达。,将一段特殊的蛋白质（或短肽）的基因构建入载体，使之与目的蛋白融合表达可形成融合蛋白（fusion protein）。表达该类蛋白的载体称为融合型表达载体，如pGEX系统。 pGEX系统包括多种载体，如pGEX-lT、pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5X、pGEX-6P等。该系统载体使用强启动子tac，紧接启动子的是SD序列及其下游的GST基因，然后是多克隆位点。用IPTG可诱导目的基因的表达，表达产物与GST融合，故可利用该标签对蛋白进行纯化。,（2）融合型表达载体用于表达融合蛋白,该类载体的优点是能把在受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚

28、至穿过细胞外膜进入培养基中。 在构建该类载体时，除有一般表达载体应有的启动子等元件外，还需含有编码信号肽的序列（通常置于SD序列下游）。 分泌型载体既可用于非融合蛋白的表达，也可用于融合蛋白的表达。 pIN 系列载体是较常用的分泌型表达载体，可使所表达的蛋白分泌到宿主菌的周质腔中。该系列载体以pBR322为基础构建而成，带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即lpp（脂蛋白基因）启动子，其中编码信号肽的序列取自大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa （外膜蛋白基因）。,（3）分泌型表达载体用于外源基因的分泌表达,pIN 系列载体有3种，即pIN -ompA1、pIN -ompA2和pIN -ompA3，分

29、别适用于使用不同密码子框架的目的基因的插入，克隆位点分别为EcoR、Hind和BamH。,（二）真核表达载体用于在真原核细胞中表达外源基因,真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。,真核表达载体中还具有： 真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、poly A 加尾信号等 真核细胞复制起始序列 真核细胞药物抗性基因,OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。注：不是所有真核表达载体都有整合序列,真核表达载体的基本组成,真核启动子和增强子在不同类型细胞中的活性差别很大。某些

30、来源于病毒的启动子和增强子，其真核宿主细胞范围较广，如Rous肉瘤病毒基因组长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）、SV40病毒早期基因的启动子和增强子、人类巨细胞病毒（CMV）启动子等。这些启动子和增强子组合可在广泛的宿主细胞中起作用，故在真核表达载体中被普遍使用。,真核表达载体带有的poly A 加尾信号可保证新转录的mRNA能有效地加上poly A。 为mRNA加上poly A依赖于mRNA 3末端的AAUAAA和其下游的GU或U富含区。 尽管全长cDNA克隆可能已带有AAUAAA序列和一段poly A，但这些序列仍不足以保证poly A的有效形成。因此，载

31、体中必须带有poly A 加尾信号。 常用的来自SV40的poly A加尾信号为237 bp，其中同时含有针对早期和晚期转录子的切割和poly A 加尾信号。两套信号作用的方向相反，并分别位于不同的DNA链上，对mRNA的加工均很有效。,酵母表达载体 昆虫表达载体 哺乳类细胞表达载体,根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要分为 ：,（1）酵母表达载体适于在酵母细胞中表达外源蛋白,根据载体在酵母细胞中复制方式的不同，可将酵母载体分为五类， YIp：酵母整合型质粒 YRp：酵母复制型质粒 YCp：酵母着丝粒型质粒 YEp：酵母游离型质粒 YLp：酵母线性质粒 除YLp外，其余各类既可在大肠杆菌

32、，又可在酵母细胞中复制与扩增。,根据在转化酵母细胞中的复制机制，又可将酵母载体分为两个基本类型： 整合型载体，如YIp包含一个酵母ura3标志基因、大肠杆菌复制起始序列以及抗生素抗性基因。该质粒缺乏在酵母细胞中进行自主复制的元件，其需通过质粒DNA与酵母DNA同源序列重组而整合至酵母基因组中 。 自主复制型载体，这类载体因在酵母细胞中有自我复制能力而得名，属于这类载体的有：YRp、YEp和YCp。,YRp含有酵母自主复制序列，但转化后缺乏有效的分离，故在有丝分裂后，质粒在亲代细胞分布极多而在子代细胞较少或丢失，在遗传学方面极不稳定。 YEp具有可诱导型的启动子、信号肽编码序列（常用交配因子序列

33、）和酵母质粒的2m环片段，此类质粒可在染色体外自主复制（约50100拷贝/细胞），其转化效率高且质粒稳定，因此常用该类载体在酵母细胞中高效表达外源基因。 YCp是由自主复制序列与着丝点序列连接而成，该类载体的特征是单拷贝（12拷贝/细胞），遗传性极其稳定。着丝点序列存在于酵母细胞每条染色体中，该序列在有丝分裂和减数分裂中能使染色体稳定而准确地复制，这是保持该类载体稳定的关键因素。,（2）昆虫表达载体可在昆虫细胞中表达真核基因,昆虫表达载体主要有两类： 杆状病毒表达载体。载体的启动子为多角体蛋白(polyhedrin)基因的启动子，所使用的外泌信号序列来自蜜蜂的milittin序列，其可在宿主细

34、胞（如Sf9或Sf20）中高水平表达外源蛋白。 果蝇表达载体。载体上的启动子有Ac5（果蝇黑素激动蛋白5C基因）启动子和MT（果蝇黑素金属硫蛋白基因）启动子，所使用的外泌信号序列为Bip序列，其可连续表达或诱导表达外源蛋白。,（3）哺乳类细胞表达载体适宜在哺乳类细胞中表达真核基因,据载体进入宿主细胞的方式分为病毒载体和质粒载体 据载体在宿主细胞内是否整合于细胞染色体DNA，可将其分为整合型和非整合型载体 整合型载体一般是随机整合入染色体，但所携带外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性，整合型载体通常用于外源基因的稳定表达；非整合型载体通常用于外源基因的瞬时表达 最常

35、用的哺乳类细胞表达载体是病毒载体,一个理想的病毒表达载体，通常应具备以下条件：, 使用安全，对宿主细胞无毒副效应； 能容纳较大的外源DNA片段且转染效率高； 所产生的病毒效价高； 外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表达 病毒的靶向性强； 外源基因的表达具有可控性。 然而，遗憾的是，到目前为止，还没有任何一个病毒载体能满足以上全部理想条件。,病毒表达载体由各种病毒DNA衍生而来，其构建时一般都把细菌质粒复制起点放置其中，使病毒载体及其所携带的目的DNA能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再转入真核细胞。 经过质粒化改建的病毒载体通常都包括病毒启动子、包装元件、遗传标记和质粒复制起点等几个部分。,

36、目前，常用的病毒表达载体包括如下多种：, 反转录病毒（retrovirus,RV）载体 RV属ssRNA病毒。 构建RV载体时，将RV的DNA插入pBR322质粒，同时删除RV的三个编码基因，保留两端的LTR和病毒颗粒包装序列，再加入供筛选的标记基因。5LTR具启动子和增强子活性并具转录起始信号，3LTR具转录终止信号。 RV载体具有较高整合和表达外源基因的能力，广泛用于转基因动物和基因治疗研究，但因其随机整合，其安全性问题需加以考虑。, 慢病毒（lentivirus,LV）载体 LV载体是以HIV-1（I型人类免疫缺陷病毒）为基础发展起来的表达载体； 与一般RV载体不同的是，它对分裂细胞和非

37、分裂细胞均具有感染能力； 该载体可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而获得持久表达； 该载体宿主细胞较广，在表达目的蛋白和小干扰RNA方面都有广泛应用 。, 腺病毒（Adenovirus,AV）载体 AV属线性dsDNA病毒； 目前，普遍使用的是AV第三代载体，载体中去除了所有AV的编码基因，仅保留了5和3末端反向重复序列（inverted terminal repeats，ITR）及病毒包装序列，病毒载体外壳的包装需要辅助病毒提供编码序列； 第三代AV载体能容纳较大的DNA片段，能较长时间地表达外源基因，其毒性和免疫原性都大大降低。, 腺相关病毒（adenovirus-associate

38、d virus，AAV）载体 AAV属于线性ssDNA病毒。 构建AAV载体时，用外源基因及其调节序列取代病毒的rep和cap编码区，仅保留两端145 bp的ITRs，负责病毒的获救、复制、包装与整合；而辅助质粒则保留所有编码序列而无ITRs。两种质粒间无重复序列，重组AAV复制和壳化所需的rep和cap基因，由辅助质粒直接以蛋白表达方式提供，故不会发生野生型病毒序列的重组、复制和包装。当AAV载体与辅助质粒共转染辅助病毒（AV）感染的细胞时，即能获救、复制并包装成重组AAV 颗粒。 AAV载体具有能稳定表达外源基因、特异整合至人的19号染色体长臂末端、病毒稳定且宿主范围广、不引发免疫反应等优

39、点 。, 痘苗病毒（vaccinia virus，VV）载体 VV属dsDNA病毒。 构建VV载体时，通常以胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因作为筛选标志。tk序列中插有该病毒的早期启动子和下游的多克隆位点。含有外源DNA的重组VV载体的tk基因不表达，当与野生型VV共转染宿主细胞并经tk同源序列重组，便可获得既有外源基因又有tk基因的重组VV颗粒，进而导入tk缺陷的细胞后，可在含有次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷的培养基中筛选，只有tk表达的细胞才能生长。 VV载体具有克隆容量大（可插入2540 kb的外源DNA片段）、可插入多个外源基因、病毒宿主细胞广且使用安全等优点。, 猿猴

40、空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）载体 SV40的基因组为双链环状DNA 人工构建的SV40载体主要有重组病毒质粒载体和取代型重组病毒载体两种类型，前者是将SV40基因组复制起点序列插入质粒载体中，从而构建成病毒-质粒载体；后者是用外源基因取代病毒基因组中与其大小相当的一个片段，从而形成取代型重组病毒载体, 单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）载体 HSV为线性DNA病毒 构建HSV载体时，通常由型HSV基因组改建而成 目前，HSV载体主要有两类，一类是即刻早期（immediate early，IE）基因缺陷型载体，通过

41、缺失这些IE基因，降低了毒性，从而使外源基因表达时间延长；另一类是利用该病毒的扩增子（amplicons）制备的载体，该类载体仅含有HSV复制起点和包装序列以及调节序列。辅助质粒为装配型质粒，其除了缺失包装序列外，包含所有HSV基因组。两种质粒共转染宿主细胞后，产生感染性重组病毒颗粒，其中仅含有HSV基因组序列，所有与毒性相关的HSV蛋白均以低水平表达 HSV载体具有克隆容量大（可插入长达50 kb的外源DNA）、外源基因可获得稳定表达、整合入宿主基因组后无致癌危险、病毒宿主范围广且有较高的转移效率和效价, 其他病毒载体 除上述病毒载体外，目前用于构建真核表达载体的病毒还有人巨细胞病毒、脊髓灰

42、质炎病毒等。此外，还有人试图利用乙型肝炎病毒等构建真核表达载体。,（一）黏粒兼具质粒和噬菌体DNA的特性,黏粒（cosmid）：又称粘性质粒或装配型质粒，是由 DNA的cos区与质粒重新构建而成的杂合双链环状DNA载体。 黏粒的特点： 含有质粒的抗性标记基因及复制起点和多克隆位点，可按质粒的方式在宿主菌中进行自主复制； 带有噬菌体DNA的cos序列，可像噬菌体DNA一样进行体外包装； 黏粒本身较小，通常只有几kb，但能容纳高达50 kb的外源DNA片段； 非重组体黏粒很小，故不能在体外进行包装，所以有利于后续阳性克隆的筛选； 黏粒因缺乏全部基因，不会产生噬斑，但在选择培养基平板上形成菌落，这一

43、点也与质粒载体一致。,三、特殊载体具有特定用途,黏粒pJB8图谱,（二）BAC、PAC和YAC用于大片段DNA的克隆,细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）基于F质粒构建而成。BAC能容纳高达400 kb（一般为50 kb250 kb）的外源DNA。 基于大肠杆菌P1噬菌体的载体（E.coli bacteriophage P1-based vector, PAC）与BAC的克隆容量相当。 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）载体能携带更大的DNA片段，其由酵母线性质粒（YLp）发展而来，含有染色体的两

44、个端粒片段，能复制出线性DNA，其克隆容量可高达3 Mb（一般为500 kb2Mb）。利用重组线性DNA转化细胞，可建成包含人全部基因组DNA的巨型YAC文库。 BAC、PAC和YAC的使用为人类基因组物理图谱和序列测定提供了强有力的工具，大大促进了人类基因组计划的完成。,端粒重复序列（telomeric repeat, TEL） 着丝粒（centromere, CEN） 自主复制序列（autonomously replication sequences, ARS）,BamH切割后形成微型酵母染色体EcoR切割形成染色体的两臂外源DNA 插入该切点形成人工酵母染色体转化入酵母菌通过复制、分裂，

45、克隆大片段DNA,（三）启动子探针型载体用于分离和分析基因启动子,启动子探针型载体（即通常所说的报告基因载体）是一种快速分离和鉴定基因启动子的工具型载体 包含两个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元包含质粒克隆载体必备的转化系统（复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞）；检测单元则包括一个已失去转录功能且易于检测的遗传标志基因以及多克隆位点。 例如，pGL3-basic就是一个典型的启动子探针型载体，它不含启动子，含有一个荧光素酶（luciferase，luc）标志基因。如果插入片段中含有启动子序列，则luc表达，否则，luc不表达，故根据luc表达与否和表达水平的高低，即可判

46、断插入片段中启动子序列的有无和活性强弱。,启动子探针型载体pGL3-basic图谱,在启动子探针型载体的基础上，还发展出了用于分离和分析其他基因表达调控元件（如增强子或衰减子）的载体。这类载体与启动子探针型载体的区别，就是自身含有启动子，故将空载体转入细胞，就有标记基因（如luc）表达。当在启动子上游或下游（乃至标记基因下游）插入外源DNA片段后，便可根据标记基因表达水平的改变来判断所插入的DNA片段中是否含有增强或抑制基因表达的调控元件。,（四）组织特异性表达载体使外源基因在特定组织表达,把某种组织特异性的调控序列（如启动子）构建于表达载体，使外源基因的表达严格受控于该调控序列，就形成了组织

47、特异性表达载体 该类载体为研究特定组织的发育和针对特定组织或器官的基因治疗提供了有效手段 目前研究较多的有乳腺组织特异性表达载体，它是基因工程药物的生物反应器；肿瘤细胞特异性表达载体能在肿瘤细胞内有效表达毒性蛋白，从而特异性杀伤肿瘤细胞；神经组织特异性表达载体，对治疗早老性痴呆具有积极作用,（五）双启动子和串联启动子表达载体各有特殊用途,一般的表达载体只有一个启动子，为了特殊需要，可给表达载体组装两个启动子，构成双启动子表达载体，旨在方便地研究不同条件下的基因表达情况或分别启动不同基因的表达。 有时为了提高目的基因的表达水平，可将两个或两个以上的相同启动子串联在一起，构成串联启动子表达载体。,

48、（六）某些表达载体用于表达非蛋白分子,有些表达载体不用于表达蛋白质，而是用于表达小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）或微小RNA（micro RNA，miRNA）等。 例如，目前，用于表达siRNA的载体已有多种（如pSilencer2.1-U6 neo，mU6pro等）。,四、载体上的常用标志或标签,载体上的标志（marker）：通常用于重组子或阳性克隆的筛选、鉴定 常见的标志有： 抗生素抗性基因 a.用于细菌重组子筛选的抗生素抗性基因 b.用于哺乳类细胞阳性克隆筛选的抗生素抗性基因 酶的编码基因 营养缺陷选择标志,标签（tag）：其编码序列通常构建于表

49、达载体，与目的基因位于同一阅读框内，这样就可使所表达的蛋白上带上标签肽。 标签肽大小不等，小的只有几个氨基酸残基，大的有几十kD。 标签肽常用于表达产物的分离、纯化与鉴定。 常用的tag序列包括 His：68个组氨酸 FLAG：八肽序列 Strep：链亲和素，八肽序列 HA：血凝素，九肽序列 Myc：十肽序列 T7：11肽序列 S：14肽序列 HSV：11肽序列 VSV-G：11肽序列 GST SPA：葡萄球菌蛋白质A MBP：麦芽糖结合蛋白 GFP：绿荧光蛋白 RFP：红荧光蛋白 VSV：vesicular stomatitis virus，口蹄疫病毒,第四节 DNA克隆的基本过程Proce

50、dure of DNA Cloning,目的DNA的分离获取（分） 载体的选择与准备（择） 目的DNA与载体连接（接） 重组DNA转入受体细胞（转） 重组体的筛选与鉴定（筛）,DNA克隆的基本过程,一、分离获取目的DNA有多种方法（分）,DNA克隆的第一步是分离获取目的DNA。 目的DNA的来源有多种，包括基因组DNA、经mRNA反转录的cDNA、PCR扩增产物、化学合成法获得的DNA等。,二、根据DNA克隆的目的选择与准备适宜载体（择）,进行DNA克隆的目的主要有二： 获得目的DNA片段； 获得目的DNA片段所编码的蛋白质 针对第一种目的，通常选用克隆载体；针对第二种目的，需选用表达载体 选

51、择载体时，还要考虑目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素 选择载体时还需注意载体内应有适宜的多克隆位点,不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞,三、目的DNA与适宜载体连接形成重组DNA（接）,（一）黏端连接为最适连接 1. 单一相同黏端连接会产生载体自连,配伍末端的连接情况与单一相同黏端连接相似,单一相同黏端连接产生载体自连,BamH I,单一相同黏端连接存在如下缺点： 容易出现载体自身环化 目的DNA双向插入载体（即正向和反向插入） 多拷贝现象 采用碱性磷酸酶预处理线性化载体DNA，使之去磷酸化，可有效减少载体自身环化 目的DNA如果反向插入载体，虽不影响基因克隆，但却影响外源基因的表达,

52、Eco R切割位点,Bg l切割位点,2. 定向克隆可有效避免载体自连和DNA片段的反向插入,定向克隆：将待克隆DNA分子和载体分子采用同一对限制性核酸内切酶切割后连接起来，可实现外源DNA片段的定向插入，此即定向克隆,3. 通过其他措施产生黏端进行连接 人工接头法 同聚物加尾法 PCR法 T-A克隆法,人工接头(adaptor或linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切割产生粘性末端，而后进行黏端连接。,人工接头（adaptor/linker ）：是借助化学合成和(或)结合退火的方法而得到的含有一种或一种以上限制性内切酶切点的平端双链寡核苷酸片段。 5-GGTG AATTCAC

53、C-3 3-CCACTTAA GTGG-5,人工接头(adaptor/linker)连接,CCGAATTCG GGCTTAAGC,5- 3-,Eco R,在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出黏端，再进行黏端连接。,加同聚物尾 5-GGTG AAAAAAACACC-3 3-CCACTTTTTTT GTGG-5,同聚物加尾连接,同聚物加尾连接,T(T)nT 3 ,PCR法产生黏端,针对目的DNA的5 和3 端，设计一对特异引物，在每条引物的5 端分别加上不同的限制性内切酶位点，然后以目的DNA为模板，经PCR 扩增便可得到带有引物

54、序列的目的DNA，进而用相应限制性内切酶切割PCR产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。,T-A克隆法,在使用Taq DNA聚合酶进行PCR时，扩增产物的3 末端可加上一个单独的腺苷酸残基（A）而成为黏端，这样的PCR产物可直接与带有3-T的线性化载体（T载体）连接，此即T-A克隆。,T4 DNA连接酶,（二）平端连接效率较低,为了提高连接效率，可采用提高连接酶用量、延长连接时间、降低反应温度、增加DNA片段与载体的摩尔比等措施 平端连接同样存在载体自身环化、目的DNA双向插入和多拷贝现象等缺点,（三）粘-平末端的连接效率介于黏端和平端连接之间,粘-平末端连接是指目的

55、DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接 以该方式连时，目的DNA为定向插入载体（即定向克隆） 该连接方式的连接效率介于黏端和平端连接之间 可采用提高平端连接效率的措施来提高该方式的连接效率,（四）快速连接法无需纯化DNA片段,该方法从低融点琼脂糖凝胶中直接切下所需的DNA片段，无需纯化，连同凝胶一起与载体DNA进行连接。本法省时省力，对DNA黏端和平端的连接均适用，但其连接效率明显低于常规连接，且DNA连接酶用量大。,四、重组DNA转入受体细胞（转）,转化（transformation） 质粒或黏粒细菌 （感受态细胞，competent cell） 质粒酵母菌（真核细胞）

56、转染（transfection） 外源DNA真核细胞（酵母除外） 噬菌体DNA感受态细菌 感染（infection） 噬菌体颗粒细菌 病毒颗粒哺乳细胞,受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent),细菌的感受态（ competent bacterium）：细菌易于接纳外源物质的一种天然状态，在细菌的对数生长前期，为了分裂增殖的需要，细菌胞膜上会表达一些特殊的蛋白质，利于外源物质穿透胞膜，帮助细菌吸收外源营养物质。基因工程操作中，通过物理化学的方法也可使细菌处于感受态。处于该状态的细菌被称为感受态细胞。,将重组DNA转入受体细胞的常用方法,化学法： 氯化钙化学转化

57、 物理法： 电击法 显微注射法 等,用氯化钙化学转化,电击法,显微注射法,五、筛选与鉴定重组DNA有多种方法（筛）,一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆 筛选与鉴定程序主要包括：先筛选出带有载体的克隆；然后筛选鉴定出带有重组载体的克隆；最后筛选鉴定出带有目的DNA的克隆 主要筛选和鉴定方法有遗传标志筛选法、序列特异性筛选法、亲和筛选法等,（一）借助载体上的遗传标志可快捷方便地进行筛选,1. 利用抗生素抗性标志可筛选出带有载体的重组子 将含有某种抗生素抗性基因的载体转入宿主细胞后，将细胞在含有相应抗生素的培养基中培养，无载体转入的细胞将被杀死，生长的细胞即是含有载体的细胞。至于细胞中的载体是否为含有目的DNA的重组载体，尚需进一步鉴定。,抗药性标志筛选,抗性平板,2. 利用标志补救筛选带有载体的重组子 标志补救（marker rescue）是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，通过互补宿主细胞的相应缺陷而使细胞在相应选择培养基中存活。利用该策略可初步筛选带有载体