CHAP1-酶工程基础.ppt

1、第一章 酶工程基础,第一节 酶和酶工程概述 第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制 第三节 酶的催化特点和影响因素 第四节 酶活力的测定 第五节 酶动力学和抑制作用,第一章 酶工程基础,第一节 酶和酶工程概述,一、酶及酶工程研究的意义 二、酶学研究简史 三、酶工程,第一节 酶和酶工程概述,第一节 酶和酶工程概述,（一）酶的概念 酶是由细胞产生的具有催化功能的蛋白质（或核酸），亦称生物催化剂。,一、酶及酶工程研究的意义,第一节 酶和酶工程概述,如：苯丙酮尿症(PKU) 患儿的苯丙氨酸羟化酶先天缺失，不能将苯丙氨酸转化为酪氨酸，苯丙氨酸在血液中累积，使大脑发育受到影响； 同时由于酪氨酸来

2、源减少，致使黑色素合成不足，出现皮肤“白化病”。,酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（ Enzymatic reaction ） 在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（ substrate ）,第一节 酶和酶工程概述,（二）酶在生命体内的重要性,1、催化生物代谢过程中的各种生化反应，以维持正常的生命活动。 2、核酸合成、复制要靠酶；出了差错，要靠修复酶进行纠正。 3、蛋白质合成，一旦错误氨基酸掺入，就要有专门的酶去识别、切除、再合成。,第一节 酶和酶工程概述,1、以酶为工具的研究 2、以酶为研究对象,（三）酶的研究,第一节 酶和酶工程概述,（1）用酶来治疗疾病 天冬酰胺酶治疗白血病 多酶片

3、(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)助消化 链激酶、尿激酶、纳豆激酶等清除血凝块,1、以酶为工具的研究,（2）基因工程用酶：内切酶、连接酶、TaqDNA聚合酶、逆转录酶等。,L-门冬酰胺 L-门冬氨酸+NH3,天冬酰胺酶治疗白血病,天冬酰胺酶能将血清中的门冬酰胺水解，而门冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸； 正常细胞有自身合成门冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当外来天冬酰胺酶使门冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞因既不能从血中取得足够门冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白质合成受阻，增殖受抑制，细胞大量死亡。,L-天冬酰胺 L-天冬氨酸+NH3,天冬酰胺酶治疗白血病,注入该酶后，人

4、体正常cell由于有L-天冬酰胺合成酶，自己能够合成L-天冬酰胺，因此细胞蛋白质合成不受影响。而癌cell本身缺乏或没有L-天冬酰胺酶，自己不能合成L-天冬酰胺，外源的L-天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉，因此细胞蛋白质的合成受到影响，引起癌cell的死亡。,第一节 酶和酶工程概述,（1）测定肝癌 A、开始：甲胎蛋白（AFP） B、 现在：“岩藻糖苷酶”（AFU） （2）神经细胞内的酶,2、以酶为研究对象,第一节 酶和酶工程概述,甲胎蛋白（AFP）是人胚胎期血清中的主要蛋白成分，其合成部位主要是在人类胚胎的肝脏。,人类胚胎在宫内发育16周后AFP迅速下降，当胎儿出生后AFP的浓度维持在较低水平

5、； 研究表面：原发性肝癌患者血清中的AFP相当于正常人的数十倍乃至数万倍。,第一节 酶和酶工程概述,“岩藻糖苷酶”（AFU）属溶酶体酸性水解酶类，参与含岩藻糖苷的糖蛋白、糖脂的降解、代谢。,研究表明：肿瘤组织中的岩藻糖转换率增加，AFU活性增高。,第一节 酶和酶工程概述,2005年3月，中科院上海科学研究院的袁小兵博士等，在自然杂志上发表原创工作，首次发现神经细胞内有二种酶：CDC42酶和RhoA酶。 功能：对神经纤维的生长导向作出精细的调节，对疼痛和止痛起调节作用。,神经细胞内的酶,第一节 酶和酶工程概述,二、酶学研究简史,公元前800年 烹调方法中已使用来自微生物的酶 1833-1835年

6、 淀粉的第一次酶解 1836年 发现消化酶-胃蛋白酶 1839-1897年 60年关于酵母的争论 1876年 酶-源于希腊语，意为在酵母中 1883年 食物中蛋白质的测定 1894年 加酶食品的第一次商业化生产 1894-1913年 科学家建立“钥匙-锁理论” 1908-1913年 在皮革软化过程中酶取代粪便 1914年 第一次生产出浓缩洗衣皂 1926年 科学家发现酶是蛋白质,第一节 酶和酶工程概述,1941-1943年 生产胰岛素和胰蛋白酶的新方法 1953-1958年 Watson 和 Crick发现DNA是双螺旋结构 1963年 碱性蛋白酶-洗涤剂用酶的突破 1967年 微生物筛选 1

7、965-1974年 淀粉工业的重大突破 1984-1986年 第一个由基因修饰的微生物生产的酶 1992年 建立用于酶工业生产的克隆表达 1995年 三维结构模型 1996年 生物多样性网络 1997年 利用分子筛选技术发现新的微生物 1998年 基因混组 1999年 生态克隆表达 2000年 Fusarium venenatum作为新的工程用菌,第一节 酶和酶工程概述,三、酶工程,（一）酶工程的概念 是将酶、细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。 是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产

8、生的交叉科学技术，是生物工程的主要内容之一。,第一节 酶和酶工程概述,（二）酶工程的研究内容,酶的生产 酶的改造 酶的应用,天然酶在开发应用方免受到限制,第一节 酶和酶工程概述,（三）酶工程的分类,根据研究和解决问题的手段不同分为： （1）化学酶工程：指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用。 （2）生物酶工程：是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。主要包括3个方面,第一节 酶和酶工程概述,（2）生物酶工程,克隆酶用基因工程技术大量生产酶（ -淀 粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶） 突变酶对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶 合成新酶设计新酶基因，合成自然界不曾

9、有过的酶,第一节 酶和酶工程概述,（四）酶工程的研究方向,1、酶的固定化 2、酶如何不被体内酶识别、降解问题 3、酶活性检测如何更简便、特异、快 速、灵敏的方法学问题 4、酶的抑制剂与激活剂 5、基因工程表达的酶制剂等,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,一、酶的分类 二、酶的命名 三、酶的组成和结构特点 四、酶的作用机制,一、酶的分类,1961年国际酶学委员会提出将酶分为6类： 1.氧化还原酶：RH+R(O2)=R+RH( H2O) 催化电子的转移 2.转移酶：RG + R=R + RG 催化功能基团的转移 3.水解酶：RR + H2O=RH + ROH 催化水解反应 4.裂合

10、酶：RR=R + R 催化非水解性、非氧化性分解 5.异构酶：R=R 催化分子内基团的转移 6.连接酶（合成酶）：R+R+ATP=RR+ADP 利用共价键将分子连接到一起,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,核酶是唯一的非蛋白酶，它是一类特殊的RNA或DNA，能够催化RNA或DNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,7. 核酶（催化核酸）ribozyme,脱氢酶：催化直接从底物上脱氢的的反应，需要辅酶I(NAD+)或辅酶(NADP+)作为氢供体或氢受体起传递氢的作用） 氧化酶：催化底物脱氢，并氧化生成H2O2或H2O等。 例如：乳酸脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,1. 氧化-还原酶

11、Oxidoreductase,催化基团转移反应：即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。 例如：谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,2. 转移酶 Transferase,催化：底物的加水分解反应。 主要包括：淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如：脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应,3. 水解酶 hydrolase,催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。 例如:延胡索酸水合酶催化的反应,4. 裂合酶 Lyase,催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如:6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。,5. 异构酶 Isomerase,又称为

12、合成酶，能够催化两个物质形成一个新物质的反应,这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 例如:丙酮酸羧化酶催化的反应 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,6. 连接酶 Ligase or Synthetase,二、酶的命名,（一）习惯命名 （二）系统命名 （三）酶的编号,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（一）习惯命名 根据 作用底物（S）：淀粉酶 蛋白酶 反应性质 ：脱氢酶 转氨酶 两者结合 ：乳酸脱氢酶 谷丙转氨酶 来源 ：胃蛋白酶 木瓜蛋白酶 性质 ：碱性磷酸酯酶 （二）系统命名 命名原则 底物1：底物2 + 反应类型 + 酶 “L-乳酸： NAD + 氧化还原 + 酶”,乳酸脱

13、氢酶（习惯命名）,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（三）酶的编号,酶的编号用四个数字表示一个酶： Enzyme Commision EC 1. 1. 1. 1 醇脱氢酶 类 亚类 亚亚类 编号 第1大类; 以CHOH为供体; 以NAD+,NADP+为受体; 1,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,三、酶的组成和结构特点,（一）酶的组成形式 1.单体酶( monomeric enzyme) ：由一条或多条肽链组成，肽链间以共价键结合的酶。 2.寡聚酶(oligomeric enzyme) ：由若干相同或不相同的亚基以非共价键结合而组成，亚基一般没有活性，必须相互结

14、合后才有活性。 3.多酶复合体(multienzyme system) ：由2个或2个以上功能相关的酶通过非共价键连接而成的、能进行连续反应的体系就是多酶复合体。,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（二）酶的结构特点,(holoenzyme) （apoenzyme） (cofactor) 全 酶 = 酶蛋白 + 辅因子 （金属离子、辅酶、辅基）,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（金属离子） （辅酶、辅基）,有活性 无活性 无活性,1、金属离子 （1）分类（据结合程度不同） 金属酶：酶蛋白与金属离子结合紧密，主要是一些过渡金属离子。 金属激酶：金属离子与酶的结合

15、一般较松散，在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。主要是一些碱金属离子或碱土金属离子。 （2）作用 活性中心的组成成分：如多酚氧化酶中的铜 在E与S之间起作用：如羧肽酶中的锌 稳定结构,2、辅酶、辅基,（1）根据与酶蛋白的结合程度可分为 辅酶(coenzyme) ：指与酶蛋白结合比较松弛的小分子有机物质，通过透析方法可以除去。例如硫胺素、焦磷酸。 辅基(prosthetic group) ：是以共价键和酶蛋白结合，结合的较紧密，不能通过透析法除去，需要经过一定的化学处理才能与酶蛋白分开。例如FAD：黄素腺嘌呤二核苷酸，FMN：黄素单核苷酸。,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,维生

16、素的特点: 1、种类多 2、需要量少 3、常常需要从食物中获得 4、大部分充当辅酶,（2）辅酶、辅基往往是由维生素参与形成的小分子有机物,脂溶性维生素： A D E K 维生素 硫辛酸（氧化型） 水溶性维生素： Vc VB: B1 B2 B3（泛酸） B5(PP) B12（氰钴胺素） B6 （吡哆醇/醛/胺） B7 (生物素 ） B11（叶酸） 硫辛酸（还原型）,维生素B1 硫胺（素）,硫胺素（B1）,功 能：以辅酶方式参加糖的分解代谢。TPP是脱羧 酶、脱氢酶的辅酶。 缺乏症：脚气病、中枢神经和肠胃患糖代谢失常。,焦磷酸硫胺素（TPP）,维生素B2核黄素,功能：作为递氢辅酶，参与生物氧化作用

17、 每人每天需要量：儿童0.6mg，成人1.6mg。动物体内不能合成维生素B2。 缺乏症： 口角炎、舌炎、唇炎、眼睑炎，角膜血管增生等症状。,维生素B3泛酸、遍多酸,功能：以CoA形式参加代谢，是酰基的载体，是体内酰化酶的辅酶，对糖、脂、蛋白质代谢过程中的乙酰基转移有重要作用。,需要量：成人每天为510mg，一般膳食的泛酸含量丰富。 未发现典型的缺乏症。,维生素B5维生素PP,包括尼克酸（烟酸）和尼克酰胺，尼克酰胺为维生素B5的化学名。,尼克酸,尼克酰胺,功能：以NAD+或NADP+形式作为脱氢酶的辅酶而起到递氢体的作用。,+2H,-2H,缺乏症：膳食中长期缺乏维生素PP会引起对称性皮炎，又叫赖

18、皮病。,维生素B6 吡哆素,包括：吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺。,吡哆醇,吡哆醛,吡哆胺,（磷酸吡哆醛，PLP）,功能：作为辅酶参加多种代谢反应，包括脱羧、转氨、氨基酸内消旋、Trp代谢、含硫氨基酸的脱硫、羟基氨基酸的代谢和氨基酸的脱水等。,缺乏症：导致皮肤、中枢神经系统和造血机构的损害，可以引发皮炎。,维生素C 抗坏血酸,功能： 促进各种支持组织及细胞间粘合物的形成，是脯氨酸羟化酶的辅酶。 对生物氧化有重要作用。 缺乏症：坏血病，毛细血管易出血，齿、骨发育不全或退化。,四、酶的作用机制,（一）酶的结构组成及活性中心 （二）酶作用专一性机理 （三）酶作用高效性机理 （四）影响酶高效性的因素,第二节

19、酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（一）酶的结构组成及活性中心,结合部位 活性中心 必需基团 催化部位 酶的结构 活性中心以外的必需基团 其它部分,1、酶的活性中心(active center) ：是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。,活性中心,2、结合部位：酶分子中与底物结合，使底物与酶的一定构象形成复合物的基团。 酶的结合基团决定酶反应的专一性。,3、催化部位：酶分子中催化底物发生化学反应并将其转变为产物的基团。 催化基团决定酶所催化反应的性质，同时也是决定反应的高效性。,4、调控基团：酶分子中一些可与其他分子发生某种程度的结合并引起酶分

20、子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用的基团。,酶的活性中心示意图,一些酶活性中心的基团,（二）酶作用专一性机理,1.锁钥模型 2.诱导契合模型,酶作用的专一性,专一性：一种酶只能作用于一种或一类底物。表现为： （1）绝对专一性：一种底物，一个反应。 如尿酶尿素 （2）相对专一性：大多数酶为相对专一 性，允许底物分子上有小变动。,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,1、锁钥模型（1890）：,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶活性部位的形状与所需作用的底物形状相吻合，它们可以象钥匙与锁一样互相匹配。 此学说可以较好的解释酶的立体异构专一性；但不能解释酶的多底物现象、酶对

21、正反方向的催化等。,锁钥模型,2、诱导契合模型（1964年 ）： 该学说认为酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，由于酶与底物相互诱导，使底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这个动态的辨认过程称为诱导契合。,诱导契合模型,动画,酶与底物靠近,定向,酶与底物相互诱导变形,契合形成中间产物,产物脱离,A. 靠近定向,靠近 电性吸引疏水作用,定向,酶,底物,诱导契合机制,B. 诱导契合,活性中心催化基团进行催化,诱导 互补性结构变化,能否契合 专一性的由来,契合,C. 产物脱离,酶复原催化剂,非酶促反应 S P 酶促反应 S+E ES P

22、+E,底物酶中间物,过渡态,产物酶中间物,酶作用的实质：在于降低反应活化能！,（三）酶作用高效性机理中间产物学说（过渡态学说）,区别：反应分两步走，活化能大大降低，因此反应容易进行。,（四）影响酶高效性的因素,1. 邻近定向效应 2. 变形或张力 3. 广义的酸碱催化 4. 共价催化（亲核催化/亲电催化） 5. 酶的活性中心为疏水区域,1、邻近效应、 定向效应,邻近效应：在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应。 定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性

23、中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。 以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点。,邻近定向效应,普通化学反应随机碰撞（受浓度、碰撞角度影响） 相当于社会上的自由恋爱 酶的活性中心相当于“婚姻介绍所” 邻近作用提高了酶活性（“婚介”）中心的底物浓度（非婚男女集中） 定向作用缩短了底物与催化基团间（“男女”）的距离 提高反应速度（成功率）108倍,2. 变形或张力,当酶与底物靠近时，不仅酶构象受底物作用而变化，底物分子也常常受酶作用而变化，也就是酶使底物分子中的敏感键发生“变形”或产生张力 ，从而促使底物中的敏感键更易于破裂

24、。因而更容易形成一个互相契合的酶底物的复合物而提高催化效率。,底物分子发生形变,同时形变,产物,3、广义的酸碱催化,广义的酸碱催化：是通过瞬时的向反应物提供质子（H+）或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。,酶分子中可以作为广义酸、碱的基团,广义酸基团 （质子供体） 广义碱基团（质子受体）,酸的催化： H+与反应物结合，其结合物更有反应性，因而反应速度大为加快。 碱的催化：从反应物上移去H+，反应速度也大为加快。 许多反应中既受酸的催化，也受碱的催化。,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,4、共价催化,（1）共价催化：酶通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，

25、使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程。 （2）它包括两种类型：亲核催化和亲电催化 亲核基团： His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等； 亲电子基团：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+ 某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。,催 化 机 理,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,亲电催化：亲电基团具有强烈亲合电子的原子中心，它的催化机理与亲核试剂正好相反。,亲核催化：亲核基团具有强烈供给电子的原子中心。它能发挥催化作用是由于能供给底物一对电子，因此可与底物共价结合。,5、酶的活性中心为疏水区域,酶活性中心处于一个非极性环境

26、中，其介电常数比在水介质（极性介质）中的介电常数低，在非极性环境中两个带电基团之间的静电作用比在极性环境中显著增高，从而有利于同底物的结合。,综上所述，酶催化作用机理： 酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契合）或底物变形使二者相互适合，并依靠离子键、氢键、范德华力的作用和水的影响，结合成中间产物，在酶分子的非极性区域内，由于酶与底物的邻近、定向，使二者可以通过亲核亲电催化、一般酸碱催化等催化方式进行多元催化，从而大大降低反应所需的活化能，使酶促反应迅速进行。,第三节 酶的催化特点和影响因素,一、酶的催化特点,（一）高催化效率 （二）强专一性 （三）可调节性 （四）活性的不稳定性,第三节 酶的催

27、化特点和影响因素,（一）高催化效率,在37或更低的温度下，酶的催化速率是没有催化剂催化的化学反应速率的10121020倍 ； 比一般催化剂催化的反应速率高1071013倍 。,第三节 酶的催化特点和影响因素,第三节 酶的催化特点和影响因素,以固氮酶为例（NH3的合成）： 植物中：25和中性pH下由固氮酶完成。 工业上：由氮和氢合成氨需要在10-90MPa条件下，还要有铁及其它微量金属氧化物作催化剂才能完全反应。,第三节 酶的催化特点和影响因素,专一性,（二）强专一性,修整作用专一性,第三节 酶的催化特点和影响因素,（1）键专一：只要求合适的化学键，对键两端的基团并无严格要求。,（2）基团专一：

28、不但要求一定的化学键，还要求键一端的基团是一定的。 a-葡萄糖苷酶 a-糖苷键 糖苷键的一端是葡萄糖 底物：蔗糖、麦芽糖,（1）旋光异构专一性：,（2）顺反异构专一性：,例如： DNA聚合酶 I：校正、切除错配核苷酸 氨酰-tRNA合成酶：校正、切除错配AA,修整作用专一性：酶存在校读功能，能对错误参入的核苷酸、氨基酸进行修正。,第三节 酶的催化特点和影响因素,（三）可调节性,酶活性的调节控制主要有7种方式： 1.酶浓度的调节 2.激素调节 3.共价修饰调节：在一种酶分子上，共价地引入一个基团从而改变它的活性。 4.限制性蛋白水解作用与酶活力调控 5.激活剂、抑制剂的调节 6.反馈调节 7.金

29、属离子和其他小分子化合物的调节,第三节 酶的催化特点和影响因素,2.激素调节乳糖合成酶,催化亚基,修饰亚基,+,乳糖合成酶,第三节 酶的催化特点和影响因素,4.限制性蛋白水解作用与酶活力调控,酶原酶在生物体内首先合成出来的无活性前体。 酶原的激活酶原必须在一定的条件下去掉一个或几个特殊的肽键，从而使酶的构象发生一定的变化，才有活性，这一过程称为酶原激活。,本质：酶的活性中心形成或暴露的过程 意义：避免自身受损伤,6.反馈调节,反馈抑制：催化此物质生成的第一步反应的酶，往往可以被它的终端产物所抑制，这种对自我合成的抑制就叫反馈抑制。例如：,第三节 酶的催化特点和影响因素,二、影响酶活力的因素,（

30、一）底物浓度 （二）产物浓度 （三）酶浓度 （四）温度 （五）pH （六）抑制剂 （七）激活剂,一、底物浓度S,在低底物浓度时：反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。,随着底物浓度的增高：反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度达到一定值：反应速度达到最大值（V max），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,二、产物浓度,正反馈调节：反应的中间产物或终产物能够起激活变构剂的作用，使酶促反应速率加快。 负反馈调节：反应的中间产物或终产物对酶起变构抑制作用，使酶促反应速率降低。,三、酶浓度,在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。 当底物浓度达到饱和

31、时，增加酶的浓度可增加反应速度，酶促反应的速度与酶的浓度成正比关系。,四、温度,温度对酶促反应速度的影响： a. 温度升高,增加底物分子的热能，酶促反应速度加快，一般温度每升高10，反应速度约增加1倍； b. 温度升高超过一定范围,会引起酶三维结构发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失，反应速度很快下降。,最适温度（optimum temperature）：使酶促反应速度达最大时的温度。,五、pH,a、影响酶分子构象的稳定性 b、影响酶分子（包括辅因子）必需基团的解离状态，影响酶与底物的结合； c、影响底物分子的解离状态。,最适pH（optimum pH）：酶反应速度最大 时的溶液pH。,pH

32、值影响酶活力的原因：,六、抑制剂,抑制作用：通过与酶分子上的某些必需基团结合，使这些基团的结构和性质发生改变，从而引起酶活力下降或丧失，这种作用称为抑制作用。 变性作用：变性剂,七、激活剂(activator）,（1）无机离子：金属离子（K+ Na+ Mg2+ Zn2+ Fe2+ Ca2+）、阴离子（Cl- Br-）、氢离子 （2）小分子有机化合物：某些还原剂、乙二胺四乙酸（EDTA） （3）生物大分子（主要是激活酶原） 无活性的酶原 有活性的酶,磷酸化酶b,磷酸化酶b激酶,金属离子的激活作用,许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。 有些金属离子可与酶分子肽链上

33、侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。 有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。,酶活力：也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。所以测定酶的活力就是测定酶的反应速率。 酶反应速率：用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。单位：浓度/单位时间,一、酶活力与酶反应速率,第四节 酶的活力测定,产物浓度,酶反应速率曲线,时间,1、底物浓度的降低； 2、酶的部分失活； 3、产物对酶的抑制； 4、产物增加引起的逆反应速度的增加。,斜率=浓度/时间=,引起酶反应速率降低的主要原因：,酶的活力单位

34、：,1、“国际单位”（IU）： 1961年提出，1个酶活力单位是指在该酶的最适条件(最适底物浓度和最适pH）下， 25C、1分钟内能催化1微摩尔底物所需的酶量，或催化1微摩尔产物形成所需的酶量。1 IU = 1 mol/min 2、Kat：1972年提出，最适条件下， 25C、每秒钟能催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量。1 Kat = 1 mol/s,1Kat = 6107 IU,二、酶的比活力 代表酶的纯度，用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。 酶的比活力=酶活力（单位）/ mg（蛋白） 单位：用IU/mg蛋白、 Kat/mg蛋白表示。 比活力大

35、小可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。,三、酶活力的测定方法,终止法：在恒温系统中进行酶促反应，间隔一段时间后终止反应，然后测定反应物的消耗量或产物的生成量，从而计算出酶活性。终止反应的方法有加热、强酸、强碱、三氯乙酸、SDS、乙醇等。 连续反应法：不需要取样终止反应，而是基于反应过程光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度等的变化，用仪器跟踪监测反应，记录结果，算出酶活力。,三、酶活力的测定方法,1.分光光度法：利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。 优点：简便、节省时间和样品，可检测到nmol/L水平的变化。 2.荧光法：主要是根据底物或

36、产物的荧光性质的差别来进行测定。 3.酶联测定法：许多酶促反应中，产物出现或底物的消失并不会引起光吸收的变化。在这种情况下要测定催化此反应的酶的活力，可将其与第二个具有特殊吸收光变化的酶反应相偶联。,酶与底物的中间产物学说,一、米氏方程 (米曼氏公式),底物浓度与酶反应速度关系的数学表达式：,第五节 酶动力学和抑制作用,1、米氏常数Km ：当v=1/2 Vmax 时的底物浓度,Km=S,Km值：是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是mol/L，与底物浓度的单位一样。,米氏常数Km k2 + k3 k1,第五节 酶动力学和抑制作用,2、关于米氏常数Km的几点说明,（1） K

37、m是ES复合物稳定性的量度 （2） 对许多酶而言，k2比k3大得多，这时的Km就变成了酶对底物的亲和力的量度，因为它的值分别依赖于ES的生成或解离（即k1、k2的值）。,高Km值弱底物结合（k2k1） 低Km值强底物结合（k2k1）,2、关于米氏常数Km的几点说明,（3）不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数，只与酶的性质有关，而与其浓度无关。 （4）Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定得到的，不同条件下具有不同的Km值。 （5）同一种酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。,1、抑制作用与抑制剂 2、抑

38、制作用的类型和特点 3、一些重要的抑制剂 4、酶抑制剂的应用（P222）,二、酶的抑制作用,1、抑制作用与抑制剂 抑制作用：由于酶分子上的某些必需基团化学性质的改变，而引起酶活力下降或丧失，但并不使酶蛋白变性的现象称为抑制作用。 （抑制作用不同于失活作用）,抑制剂（inhibitor） ：能够引起抑制作用的物质，可以是正常细胞代谢物，也可以是外源物质。 （抑制剂不同于变性剂）,2、抑制作用的类型 （1）不可逆抑制作用 （2）可逆抑制作用 ,（1）不可逆抑制作用(irreversible inhibition) 定义：抑制剂与酶的活性中心的功能基团共价结合而抑制酶的活性,不能用透析或超滤等物理方

39、法除去抑制剂而恢复酶活性。 专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂只作用于某种酶活性部位的必需基团或一类酶。 非专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂作用于酶分子上一类或几类不同的基团或作用于几类不同的酶。 如：酰化剂酸酐和磺酰氯等可使酶蛋白的-OH、SH、NH2等发生酰化而使酶失活。,不可逆抑制作用恢复酶活性的方法,例如： 有机磷杀虫剂 乙酰胆碱脂酶（Ser-OH）,不可逆抑制,（2）可逆抑制作用(reversible inhibition) 定义：抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失，抑制剂可以通过透析等物理方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。 根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：,区别,可逆竟争性抑制（Competitiveinhibition）,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。,竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,S,例1：丙二酸和戊二酸对琥珀酸脱氢酶结合但不能催化脱氢。,可逆竞争性抑制示意图,I,例2：磺胺类药物及其作用机理,磺胺类药物可以抑制细菌的生长繁殖，治疗细菌引起的各种疾病。 磺胺类药物是对氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶。,