GB 15994-1995 流行性感冒诊断标准及处理原则

Gs15994一1995

前言

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过空气飞沫传播。流感病毒

有甲、乙、丙三个型，其中甲型所引起的流感流行最为广泛和严重，乙型常引起爆发，丙型则多引起小儿

散发病型。在我国虽将该病归属于法定丙类传染病，但一旦流行，传播快、波及面广，对人民健康及劳动

生产力有很大影响，而且对年老体弱多病者及婴幼儿的威胁较大。为贯彻执行《中华人民共和国传染病

防治法》及《中华人民共和国传染病防治法实施办法》，特制定本标准

本标准的附录A是标准的附录;

本标准的附录B、附录C都是提示的附录

本标准由中华人民共和国卫生部提出。

本标准起草单位:中国预防医学科学院病毒学研究所

本标准主要起草人陶三菊。

本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。

中华人民共和国国家标准

流行性感冒诊断标准及处理原则

GB15994一1995

Diagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementofinfluenza

1范围

本标准规定了流感的诊断标准及处理原则。

本标准适用于各级各类医疗、卫生、保健机构和人员对流感的诊断、报告和处理的应用。

2诊断原则

流感流行时一般根据临床症状、结合流行病学可对病人作出初步诊断。如确定诊断则需要分离病毒

阳性或病人双份血清抗体，测定恢复期抗体较急性期增高4倍或以上。

3诊断标准

3.1流行病学史

在流行季节一个单位或地区同时出现大量上呼吸道感染病人;或近期内本地区或邻近地区上呼吸

道感染病人明显增多;或医院门诊上呼吸道感染病人明显增多。

3.2临床症状

3.2.1出现急起畏寒、高热、头痛1头晕、全身酸痛、乏力等中毒症状。

3.2.2可伴有咽痛、干咳、流鼻涕、流泪等呼吸道症状。

3.2.3少数病例有食欲减退，伴有腹痛、腹胀、呕吐和腹泻等消化道症状。

3.3实验室诊断

3.3.1血液化验检查白细胞总数不高或偏低。

3.3.2从病人鼻咽分泌物分离到流感病毒(见附录A)e

3.3.3恢复期病人血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期有4倍或4倍以上升高(见附录B)o

13.4直接检查呼吸道上皮细胞的流感病毒抗原阳性(见附录C中C1),

13.5标本经敏感细胞增殖1代后查抗原阳性(见附录C中C2),

3.4病例分类

3.4-1疑似病例

具备3.1加3.2或3.1加3.2加3.3.1e

3.4.2确诊病例

疑似病例加3.3.2或3.3.3或3.3.4或3.3.5.

4处理原则

4门旱期隔离病人、对症治疗病人和防治合并症

早期发现病人、早期隔离病人是最重要的措施。对病人治疗一般采用对症治疗。防治并发症主要应

防止流感病毒性肺炎和细菌性肺炎，特别是对年老体弱者或伴有心血管、慢性呼吸道疾病者或婴幼儿，

国家技术监督局1995门2一15批准1996一07一01Ova

GB15994一1995

流感本身或其合并症可能引起死亡，应特别注意加强治疗护理。

42预防措施

般采用综合性预防措施，讲究卫生，注意体格锻炼和营养，保持室内空气流通;对易感人群应采取

相对隔离措施，如避免接触病人，不去公共场所等;对年老体弱者必要时可采用灭活疫苗接种或服用金

刚烷胺等预防方法(但须注意金刚烷胺仅对防治甲型流感有效)

GB15994一1995

附录A

(标准的附录)

病原学诊断方法

A1病毒分离

从疑似流感病人呼吸道采集标本分离病原体。

A2标本的收集和处理

A2.1标本收集时间应于发病早期((1-3d内)越早越好。

A2.2标本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用于采集儿童标本，采集时将灭

菌棉拭子稍沾标本收集液(pH7.2-7.6含20%-40%灭菌肉汤的生理盐水或Hanks液或生理盐水)，

反复擦拭患者咽部数次，然后将此棉拭子放进装有上述收集液的试管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用于采集

成人标本，采集时先让患者咳嗽，然后用lOmL左右的收集液反复洗漱咽喉部约lmin，吐入管内。如有

条件，儿童标本用负压抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人标本用鼻咽洗液，可提高分离的阳性率。标本采集后

羚冰壶(4'C)中尽快送实验室。

A2.3标本的处理:用毛细吸管反复吹打标本液(如为咽拭子标本，先反复挤压咽拭子后弃之)，将粘液

打散，于4'C静置5-10min，待自然沉淀后取3mL上清，按每毫升加青霉素100。单位和链霉素l000pig,

混匀置4C处理2-4h即可接种。如标本污染较重，可置4‘C过夜处理。如预计标本在48h内不能完成

接种时，应将标本置低温(最好一70'C)保存。

A3接种及培养法

最常用鸡胚培养法和组织培养法，有条件的亦可同时用两种方法进行病毒分离。

A3门鸡胚培养法:取9.11日龄鸡胚，将处理过的标本液经羊膜腔和尿囊腔各接种0.2mL，每份标本

接种3-4只胚，置33-35'C温箱培养3d，然后将鸡胚放置4℃冰箱过夜(或置一20℃冰箱1h再置40C

数小时)即可分别收获尿液和羊水，并作初步血凝(其方法是用毛细吸管取1^-2滴尿液或羊水，置大孔

塑料板内，再加入1-2滴1%鸡红细胞，摇匀后置室温或40C30~45min观察结果，根据血球凝集程度

的不同可分为++++、+++、++、+、士、一)，如血凝为+++~++十十时，再按系列倍比稀释测

定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鉴定。如血凝阴性，可盲传2代，如仍为阴性则弃之。

A3.2组织培养法:用0.2mL处理过的标本液接种于长成单层的原代人胚肾(或猴肾或地鼠肾)，或狗

肾传代细胞(MadinDarbyCanineKidney,MDCK)，每份标本接种4管，置37℃吸附1-2h后弃标本

液，再加入每毫升含2pg胰酶的199维持液1mL，于33℃培养7-10a，并逐日观察病变。从第三天开始

每隔一天用。4%鸡或豚鼠红细胞对培养管做红细胞吸附试验(试验前无菌法收获细胞培养上清液)，

如阴性则用已收获的上清液盲目传代，如阳性则测定上清液的血凝滴度。如标本第1代红细胞吸附试验

阴性，可用收获的全部上清液混合进行盲传2代，仍为阴性则弃之。

A4新分离株的鉴定

新分离流感病毒可用血凝抑制、补体结合、中和以及血细胞吸附抑制等试验方法进行鉴定最常用

和最简单的方法是血凝抑制试验，必要时采用补体结合试验。

A4门血凝抑制试验:用当前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清与新分离流感病毒做

血凝抑制试验，观察新分离株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制试验方法见附录Bo

A4.2红细胞吸附抑制试验:取红细胞吸附试验阳性的组织培养管和正常细胞对照管，用Hanks液洗

细胞2次，加入经霍乱滤液(RDE)处理(1:10)的免疫血清。.2mL，再加入HanksO.6mL，室温作用

GB15994一1995

30min后，再加入。.4写鸡(或豚鼠)红细胞0.2mL,置室温30min后于普通光学显微镜下观察有无血球

吸附如果血细胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分离的病毒与所用免疫血清型别相一致或接近

A4-3补体结合试验如果用已知的甲型(甲3、甲1)或乙型或丙型流感病毒免疫血清对新分离病毒的

血凝均不能抑制，则应考虑可能为甲型流感病毒的新亚型，可用针对甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫

血清作补体结合试验定型。

附录B

(提示的附录)

血清学诊断方法

B1血凝抑制试验方法

B1门原理

一些动物红细胞(如鸡、豚鼠等)以及人“O"型血红细胞上有流感病毒受体，遇流感病毒可产生红细

胞凝集现象，简称血凝。若将特异性抗体与流感病毒(血凝素)预先作用后再加入红细胞则不产生凝集，

称为血凝抑制现象用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为

血凝抑制抗体效价

Bl.2主要材料

大孔塑料板，lml_吸管或lml移液器。

Bl.3双份血清收集及处理

急性期血清于发病3d内采取，恢复期血清于发病后2-4周采取。取。-lml已分离的血清加入0.9

(或0.4)ml雀乱滤液(RDE)(即1:10或1:5稀释)摇匀，于37C水浴中过夜，以去除血清中的非特异

性抑制素，次日段56C水浴50min以灭活多余的RDEo

川.刁流感病毒血凝素制备

流感病毒接种鸡胚后48h收获的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。为了延迟尿盐沉淀可先用无

菌生理盐水做等量稀释，置4'C备用。

B1.5鸡红细胞悬液的制备

从静脉或心脏抽取正常健康鸡血，保存于阿氏(Alsevers)液中，置4C保存。用前以生理盐水洗3

次，末次经2OOOr/m二离心lOmin，将红细胞用生理盐水配成1%浓度。

B1.6血凝素滴定

将流感病毒血凝素在大孔塑料板内用生理盐水从1:5开始做系列倍比稀释，每孔。.25mL再加入

等量1%鸡红细胞，摇匀，置室温或4'C30-45min后观察结果，以出现++血凝的血凝素最高稀释度为

其血凝效价，即为1个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1:320，为1个单位，

4个单位即为1:80稀释。正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验。

Bl.7血凝抑制试验步骤

Bl.7门将t_述已处理的待检血清(1:10或1:5)再用生理盐水做系列倍比稀释，每孔加0.25mL,

Bl.7.2加入等量已配好的4个单位血凝素。

Bl.7.3每孔加入0.25mL1%鸡红细胞，摇匀置室温或4'C30-45mino

B1.8结果观察

观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟，待阴性孔内红细胞自由下滑呈泪滴状时读结果以出现完全抑

制的血清最高稀释度的倒数为抗体的效价。在检测患者双份血清时需在同一次试验中进行，并以恢复期

血清抗体效价较急性期抗体效价升高4倍或4倍以上为阳性。

GB15994一1995

B2型特异性补体结合试验

B2.1原理

甲、乙、丙三个型流感病毒各具有特异的可溶性抗原(核蛋白抗原)，甲型流感病毒各亚型均具有相

同的可溶性抗原，与乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用补体结合试验来区别它们。当流感

病毒出现很大的变异或出现新亚型而引起大流行时，由于来不及充分掌握新分离毒株的性状，常需同时

采用补体结合试验和血凝抑制试验对新毒株进行血清学诊断。

B2.2型特异免疫血清制备

B2.2.1免疫用抗原

甲型为PR8株和乙型为Lee株均为小鼠适应株。于乙醚麻醉下鼻腔感染12-16g小鼠，每鼠

。05-1，待感染后3-5d大部分小鼠发病、部分死亡时，解剖小鼠。取肺研磨并用生理盐水制成10%的

悬液，低速离心去除粗块，取上清鼠肺悬液即为免疫用抗原。

B2.2.2免疫血清制备

选体重300---500g的健康豚鼠，免前采血3-5mL，分离血清分装冻存留作对照。豚鼠用乙醚轻度

麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺悬液抗原。.5mL，共免疫3-4次，每次间隔一周，在末次免疫的同时，由腹腔

注射鼠肺悬液2mL，一周后试血，如果对同型尿膜抗原的血清效价超过1:80，而与异型抗原无交叉反

应，立即采血分离血清分装冻存于低温(-20'C以下)。试验前血清于56℃水浴灭活30min,

B2.3可溶性抗原的制备

用甲、乙型流感病毒或新分离病毒按常规接种和收获尿囊液，如尿液血凝在1:40以上时，收获其

尿囊膜，将尿囊膜用盐水洗一次，用无菌剪刀将膜剪成数小块放入试管中，每个鸡胚的尿囊膜加1MI无

菌生理盐水，冻化三次，末次化后以3OOOr/min离心15min，吸出上清即为可溶性抗原，加入1:10000

的硫柳汞防腐，置4℃冰箱至少可用一个月。

B2.4双份血清采集

收集病人急性期(发病3d内)和恢复期(发病10-30d后)的血清。血清于试验前560C30min灭活。

B2.510a绵羊红细胞悬液制备、溶血素、补体的制备和滴定按常规方法。

B2.6补体结合试验步骤

按常规进行。

B27结果判定

B2.7.1被检病毒尿膜抗原与甲型(或乙型)流感病毒免疫血清呈阳性反应则可诊断为甲型(或乙型)

流感病毒.如甲、乙均为阴性时，应考虑丙型流感病毒或其他病毒。

82.7.2双份血清对甲型(或乙型)抗原有4倍或4倍以上升高，即可诊断为甲型(或乙型)流感病毒感

染。

B2.7.3正常人群补体结合抗体滴度一般在1:16以下，如单份恢复期血清抗体在1:32以上时，结

合临床症状可作诊断的参考。

B2.7.4人群血清抗体水平调查中，补体结合抗体在1:32以上者可作为新近感染流感的证据。

B3神经氮酸酶抑制试验

B3.1原理

胎球蛋白((Fetuin)底物经流感病毒的神经氨酸酶作用后，使N一乙酞神经氨酸游离出来，经过碘酸盐

的氧化作用将N一乙酞神经氨酸转化为各甲醛丙酮酸，后者经硫代巴比妥酸作用形成生色团，用有机溶

剂提取生色团，并在分光光度计上比色。利用上述反应可测知流感病毒的神经氨酸酶活性，反应的颜色

越深酶活性越强。并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量。神经氨酸酶抑制试验是将标化好剂

++的神经氨酸酶(即一定稀释度的流感病毒尿囊液)和系列稀释的被检血清和正常血清一起孵育，测知

GB15994一1995

血清作用于神经氨酸酶活性的抑制效价，并计算出血清的神经氨酸酶抑制滴度。

B3.2器材及试剂

B3.2.1小试管、IOmL吸管及分光光度计等。

B3.2.2磷酸缓冲液(PBSpH5.9)及生理盐水。

B3.2.3胎球蛋白底物液:450^-500mg冰冻干燥的胎球蛋白加蒸馏水1oml_,溶解后置4'C保存，每周

新配。

B3.2.4过碘酸钠溶液:称4.8g过碘酸钠(NaIO,)溶于38mL蒸馏水中，加62mL正磷酸(浓)，充分混

合，段于棕色磨日瓶中，室温保存

B3.2.5砷试剂:称log砷酸钠(N.AsO,)和7.1g无水硫酸钠溶于100mL蒸馏水中，加0.3mL浓硫

酸，,'6于带玻璃塞的瓶中，置4(保存

B3.2.6硫代巴比妥酸试剂称1.2g硫代巴比妥酸和14.2g无水硫酸钠加入200mL蒸馏水中，在煮沸

的水浴中加热溶解.每周新配

B3.2.7酸化丁醇试剂:于100mL正丁醇中加入5m]浓}m酸，M棕色带玻璃塞的瓶中室温保存

B3.3神经氨酸酶活性测定

B3.3.1病毒用生理盐水做系列倍比稀释(1:2^1:32)分装小试管，每管0.1mL标准病毒和未知病

毒的神经氨酸酶应在同一试验中测定。

B3.3.2每管补充加入。.lnil生理盐水，再加入0.1mL用pH5.9PBS配制的胎球蛋白底物，对照管

用盐水代替病毒，充分混合后置37C水浴作用18h.

B3.3.3从水浴中取出试管在室温冷却，每管加入。.1ml的过碘酸盐试剂，充分混合，室温静置20min

(时{e」要准)

B3.3.4每管加入1mL砷试剂，由于碘的释放出现棕色，摇动试管待棕色消失。

B3.3.5每管加入2.5m1硫代巴比妥试剂，并充分混合(该试剂需在煮沸溶解后加入)，用棉塞将管口

堵’紧

B3.16立刻将试管:R-于煮沸的水浴中，煮沸10min，可见红色出现，即为神经氨酸酶活性的表现，颜色

越深酶活性越高。

B3.3.7将试管置冰水中冷却后去掉棉塞加入4ml.-j-醇试剂，换上干净橡皮塞，用手剧烈摇动试管，

提取颜色使其转到有机物(丁醇)相

B3.3.8以1500r/min离心5-l0min使丁醇层清亮透明，小心地吸出上层的丁醇，放入干净的试管中

待检

B3.19将上述受检样品由高稀释度到低稀释度依次倾入透光池中，其中第一个透光池加入无病毒的

对照管液，将分光光度计波长调至549nm，将对照管调至零，然后依次读取每个稀释度样品的光密度。

B3.3.10酶单位的计算:酶活性测定时光密度为0.45-0.85的病毒稀释度作为一个酶单位。

B3.4神经氨酸酶抑制试验

B3.4门按上述方法测定酶活性，选用1个酶单位的病毒稀释度(即酶活性测定时光密度为。.45-

0.85的病毒稀释度)，每管加入。.lml

B3.4.2受检血清做系列倍比稀释，每管病毒加入不同稀释度血清。.1mL，血清对照管是以最低稀释

度血清加生理盐水代替病毒，37C水浴作用1h。以同法做正常血清对照组。

B3.4.3每管加入pH5.9PBS配制的胎球蛋白0.lml，充分摇匀，置37℃水浴中孵育18h,

B3.4.4t!水浴中取出试管，按B3.3.3.^-B3.3.7逐步加入前述各种试剂。

B3.4.5测定光密度时应从低稀释度血清管至高稀释度血清管，检测方法同B3.3.9e

B3.5神经氨酸酶抑制抗体滴度的计算法

B3.5门根据抗血清和正常血清两组试验的实验结果，求得侮组血清同一稀释度的光密度之商数，即

xj经血清作iii后所余之酶活性的百分数。血清稀释度越高.残m的酶活性也越高，找出50酶活性前后

GB15994一1995

两个血清稀释度及其相应的酶活性百分数，按公式计算出血清神经氨酸酶抑制抗体滴度。

83.5.2计算公式

，一(B}一。2)兴+Bx

(Bl)

式中:A—血清神经氨酸酶抑制抗体效价倒数;

B,酶活性高于50%的血清稀释度倒数

执—酶活性低于50%的血清稀释度倒数

C—高于50%的酶活性的百分数;

C—低于50%的酶活性的百分数;

5。—常数。

B3.5.3计算举例

先计算血清作用后的酶活性:

血清稀释度(0.51oa10

1.01.52.02.53.03.54.0

免疫血清+1单位病毒

正常血清+1单位病毒

神经氨酸酶活性，%

0.046"0.0520.0600.0740.2880.4220.592

0.8620.8640.9020.6760.6220.6040.612

56711457097

”光密度。

然后将对数稀释度换算为几何稀释度:例如10-'换算为1/1000,10-”换算为1/3200.最后代入公

(3200一1000)

70-45

50-45

+1000=2200令5+1000二1440

此抗血清的神经氨酸酶抑制效价为1:1440.

附录C

(提示的附录)

流感快速诊断方法

cl直接检查呼吸道脱落上皮细胞内抗原

cl门原理

由于流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流

感病毒抗原，通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断。检查方法可采用免疫荧光法，一般于3-4h

内即可完成，而且可以直接定型。

c1.2标本的收集和制片

儿童标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物，成人标本最好采用鼻咽洗液。可将每份标本分为

两份，一份低温冻存备作病毒分离，一份用pH7.2磷酸缓冲液(PBS)，将粘液吹打散，1500r/min离心

15min去除上清，细胞沉淀用PBS洗1-2次，末次离心后弃上清，加人适量pH7.2PBS使细胞重悬，滴

加于带圈的玻璃片上，自然干燥，冷丙酮固定10min,

cl.3间接免疫荧光法

cl.3门用10%新鲜羊或牛血清封闭标本片，置湿盒中于37`C30min.

C1.3.2分别加入适当稀释度的抗甲型和乙型流感型特异性单克隆抗体，置湿盒中于37℃放置1h。在

PBS中洗两次，共IOmine

c815994一1995

c1.3.3加适当稀释度的兔抗鼠荧光素结合物置37C1h。在PBS中洗三次，共lOmin，末次用蒸馏水过

_一F

c1.3.4于荧光显微镜下观察结果，观察到三个以上胞浆内或胞核内荧光阳性细胞即可判为阳性。

C2标本经敏感细胞增殖，代后查抗原

c2.1原理

病人呼吸道标本经接种敏感细胞(狗肾传代细胞MDCK)增殖1-3d后，将细胞消化分散制成抗原

片再用免疫荧光法或免疫酶染法检查细胞内抗原。由于标本中的病毒在敏感细胞增殖后查抗原，能明

显提高其诊断的敏感性，可在细胞病变出现以前查到抗原，可以直接定型，而且比常规鸡胚分离病毒法

要快得多，一般24^-72h即可诊断。检查方法可采用间接免疫酶染法((C