RNA-SEQ原理及应用.ppt

1、RNA-seq技术原理和应用，报告人：柳晓东2012.4.16，1，RNA-seq技术简介2，RNA-seq技术原理3，RNA-seq技术优势4，RNA-seq技术优势或RNA序列也被称为转录组序列，mRNA 一种利用高吞吐量测量序列技术对小型RNA和非编码RNA (NC RNA )的全部或一部分进行序列分析的技术。 转录组的意思：转录组是指特定组织或细胞球在某种发育阶段或功能状态下转录的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非查询密码RNA(non-coding RNA，ncRNA )。 转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，对于解读染色体组功能的原件、阐明细胞球及组织分子组成是必要的

2、。 关于ncRNA、ncRNA的一些知识：非查询密码RNA(ncRNA )主要具有调节转波特酒RNA(tRNA )、核糖体RNA(rRNA )、小核RNA(snRNA )、以及非查询密码化RNA对基因的表达的作用，如对染色体结构的影响、rnna 近年来，利用RNA-seq进行序列分析的多篇文章中包含了ncRNA的分析，发现了很多新的ncRNA。 二、RNA-seq技术原理、RNA-seq实验程序流程图，首先得到细胞球总RNA，然后根据实验的需要，例如测定mRNA、ncRNA、smallRNA等，对RNA样本进行处理。 处理后的RNA进一步碎片化，进行逆转录形成cDNA，获取cDNA实时拉力赛，

3、将连接器连接到cDNA片段的两端，最后以下一代高通量测量序列进行测序。 所谓高通量测定序列、高通量测定序列技术(High-throughput sequencing )，能够一次并行测定数十万到数百万个DNA分子的序列，每个序列测定的读取长度一般是短的序列高吞吐量测量序列技术给传统序列带来了革命性的变化，同时对数十万到数百万的DNA分子进行序列测量，因此在某些文献中被称为下一代序列技术(next generation sequencing )， 高吞吐量测量序列使云同步能够对某个转录组和染色体组进行细致的整体分析，对三种高吞吐量测量序列进行了概述： 2005年以来，新一代的测序仪标记了Roch

4、e公司的454项技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术此后，Helicos Biosciences公司又发布了单分子序列测定(SMS )技术。 3种高通量测量序列技术的优缺点，高通量测量序列中重要名词的解释，1，定序深度：定序所得总碱数与待测染色体组大小之比。 设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，测序深度为10。 2 .展望：通过序列确定得到的序列占染色体组整体的比例。 由于存在染色体组中的高GC含量、重复序列等复杂结构，序列确定的最终史迪奇组装序列往往不能复盖所有区域，这些个区域称为Gap。 两者的关系：序列深度和染色体组的展望度之间存在正相关关系

5、，序列错误率和假阳性结果随着序列深度的提高而降低。 如果序列决定深度在1015X以上，就能保证控制基因组的展望度和序列决定错误率。3、rpkm (readsperkilobasepermillionreads )是每百万个读段中从某个基因开始每千个碱基长度的读段数。 其公式为：total exon reads指被某基因映射的reads数，mapped reads指从map到所有基因的总reads数。 RPKM不仅规范了测序深度，而且规范了基因长度，因此不同长度的基因在不同测序深度得到的基因表达水平估计值具有可比性，是目前最常用的基因表达估计方法。三、RNA-seq技术的优越性在于，相对于传统的

6、sanger测序方法，RNA-seq具有以下优势： 1、数字化信号：直接测量各传输手抄本片段序列、一元酸极限分辨率精度，并且是传统微阵列单孢杂交的荧光模拟2 .灵敏度高：稀有的转发手抄本，可检测出细胞球中的至少几个拷贝。 3 .任意种类的全染色体组分析：由于不需要设定和修正特异的探针，所以不需要知道种类的基因信息，可以对任何种类进行直接转印组分析。 能够在云同步中检测未知基因，发现新的转录手抄本，正确识别可变剪切位点和cSNP、UTR区域。SAGE、序列分析、基因表达系列分析MPSS、massivelyparallelsignaturesequencing、大规模残奥信号序列分析、4、rna-

7、。 1、转录手抄本结构的研究利用单盐化学基极限分辨率的RNA-Seq技术，可以使基因注释多方面的内容极为丰富，包括5/3边界鉴定、UTRs区域鉴定及新的转录区域鉴定等。 RNA-Seq也可以对可变拼接进行定量研究。 2 .遗传手抄本变异研究在发现序列差异方面，如融合基因鉴定、查询密码序列多态性的研究等，RNA-seq也有很大的潜力。 3、非查询密码领域功能研究转录组学研究的重要方面之一是ncRNA的发现与分析。 ncRNA根据其功能分为留守ncRNA和调节ncRNA。 前者通常表达稳定，对细胞球存活发挥重要的一系列功能，主要包括转移RNA(tRNA )、核糖体RNA(rRNA )、小核RNA(

8、snRNA )及小核RNA(snoRNA )等。 后者主要包括以长链ncRNA(lncRNA )和microRNA为代表的小ncRNA(small ncRNA )，在表观遗传学、转录及转录后等多方面调控基因表达。 4、基因表达水平的研究与以往的芯片技术相比，RNA-Seq技术能够更准确地确定细胞球中RNA的表达水平。 原则上，RNA-Seq决定了细胞球群中每一分子的绝对数量，可以直接比较实验间的结果。 RNA-Seq的一个特别强大的好处是，可以捕获不同组织或状态下的转移组的动态变化，而无需复杂地标准化数据定径套。 5、低丰度新转手抄本的确定可以利用转位子标签和芯片技术获得新的转手抄本，但是工作量太大，结果不确定。 RNA-Seq不被本底噪声问题所困扰，结果的精准性高，因此被用于发现新的转发手抄本。 近年来，酿酒酵母、栗酒裂殖酵母、拟南芥、水稻、小鼠、人白念珠菌转录组测定结果均显示大量新的转录区，其中多数转录水平低于已知的cDNA基因。 RNA-seq序列数据的分析、五、RNA-seq的发展前景、RNA-seq相对于传统序列方法