实例图解简并引物设计课件

1、1,PPT学习交流,实例图解简并引物设计,一、序言 设计一对合适的引物是PCR 扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成，却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y 病毒CP 基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、同学批评指正。 二、相关工具 ME

2、GA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑； DNAMAN8-检测两引物的互补性； Oligo Calc-评估引物的属性； Web Logo 3-直观显示简并碱基。,2,PPT学习交流,三、基本原则 设计一对好的引物，归结起来就是 5端引物、3端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处： 两引物的序列要与模板的序列紧密互补； 两引物不能在模板的非目的位点发生错配； 两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。 四、延伸原则 引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过 38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合 DNA 聚合酶反应； GC 含量：一般介于 40%-60%之间，且两个引物之间的

3、 GC 含量相差不能过于悬殊； 碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的 GC，GC 富集区容易导致错误引发反应。,3,PPT学习交流,五、特别注意,5端引物的作用主要限定 PCR 产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从3端开始的，所以 3端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3端引物时，需要综合考虑以下几个内容： 不要终止于密码子的第 3 位； 末位碱基避免使用碱基 A； 避免出现3 个以上连续的G 或C，如GCG 或CCC 或GGG； G 的绝对值不可超过 9； 与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8 个互补碱基源； 不能进行任何修饰。,4,PPT

4、学习交流,六、设计流程,5,PPT学习交流,七、示例背景,马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是侵染马铃薯、烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR 技术具有高度的特异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY 检测最常见的方法。但由于PVY 株系分化严重，不断有新的重组株系产生，单一的特异性引物无法适应PVY 不同株系的检测需求，需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。,6,PPT学习交流,八、详细图解,1. 序列准备： （1）GenBank 下载PVY 全基因组序列； （2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT 多重

5、序列比对； （3）扩增片段区域选择，CP 基因长度及位置如下图所示：,7,PPT学习交流,先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角Site处直接输入CP 基因上游分界点位置（8391）后回车。接着点击“Speicaes/Abbrv”和8391 那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。,8,PPT学习交流,裁切后得到CP 基因编码区序列，“Export Alignment”导出CP 基因序列（推荐fasta 格式）。,9,PPT学习交流,2. 引物设计,推荐先设计3端引物，至于原因，上面的【特别注意】中已提到，这里

6、不再赘述。 （1）选择引物序列 综合考虑引物设计原则及特别注意，在CP 基因3端位置选取一段合适的序列（784-803bp），804bp 位置为A 且是第三个密码子位置，所以弃去末位的 A 碱基。,10,PPT学习交流,PS：是否位于密码子的第3 位，可以通过“Tranlated Protein Sequences”-“DNA sequences”切换查看，如右图，CP 基因的末端3 个碱基是终止密码子所在的位置，A 是第三位密码子。,11,PPT学习交流,（2）生成 Seq Logo 选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序列，保留CP 基因3端序列，同样导出为Fasta文件，将序列粘贴入Web

7、 Logo3的文本框内或直接上传序列文件，设置相关参数后点击“Create”生成 Seq Logo 格式的文件CP-3.fas。 参数设置： “Output format”（输出格式）推荐用“PDF”，“Color scheme”（颜色方案）推荐用“Classic (NA)”，设置完毕，点击右下角“Create Logo“即可得下图的Seq Logo 格式文件。,12,PPT学习交流,通过Web Logo 生成的多重比对图片可以很直观得到3端序列为CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG，查询简并碱基代码表（下图），可知C/T/G=B，G/A=R，简并度=3 2 =6，整理

8、后3端序列为 CTTGGAGTBAARAACATGTG，故而需要合成的3端引物序列： CACATGTTYTTVACTCCAAG （与原序列是反向互补关系）。,简并碱基代码,13,PPT学习交流,3. 质量评估,（1）参数评估 将初步得到的引物序列，粘贴入Oligo Calc 的文本框内，按下“Calculate”按钮，得到引物的相关参数，如：长度、GC 含量、Tm 值等信息。 （2）自身互补性（Check Self-Complementarity） 点击“Check Self-Complementarity”，检测引物自身互补性，主要查看“Potential hairpin formation

9、”、“3 Complementarity”、“All potential self-annealing sites are marked in red (allowing 1 mis-match)”下方显示内容，如果三项均为“none”，则说明引物自身不会形成发夹结构且引物自身不会互补，引物没问题！,14,PPT学习交流,15,PPT学习交流,（3）BLAST 比对回检,点击“Blast”可以对引物进行BLAST 比对检测，结果显示，都是PVY CP 基因相关的序列，表明所设计的引物特异性良好。,16,PPT学习交流,17,PPT学习交流,（4）两引物互补性检查,同样方式，得到5端序列：GSA

10、AAYGAYACAATYGATGC，根据引物设计原则，需要检测两引物之间是否存在序列互补。 打开DNAMAN，依次在“Primer”-“Load primer”，粘贴任意一端引物序列，如：5端序列-GSAAAYGAYACAATYGATGC，确定。,18,PPT学习交流,19,PPT学习交流,接着，在“Primer”-“Two primers Complementarity”-“Second Primer From Input”，粘贴入另一端序列，这里为3端引物序列：CACATGTTYTTVACTCCAAG，如下图：,20,PPT学习交流,结果显示，两引物间仅有3 个碱基互补，且自由能仅为1.8

11、 Kcal/mol。,21,PPT学习交流,（5）实验验证,PCR 扩增采用的 50L 反应体系为：10 TransTaq HiFi Buffer II 5 L，2.5nM dNTPs 4 L， 5端引物（10 mol/L）2 L，3端引物（10 mol/L）2 L，ddH2O 34.75 L，TransTaq HiFi Polymerase（5 U/L）0.25 L，cDNA 2 L。 PCR 扩增程序条件为：94预变性5min，94变性30s，55复性30s，72延伸1min，共30 个循环，最后一轮循环后72延伸10min。反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，如下图所示：,22,PPT学习交流,M.DNA 分子量标准（100bp）；泳道1-5：PVY 的不同株系（C、O、N、NTN、N-Wi）；泳道6-7：阴性对照（健康马铃薯）和空白对照；泳道8-12：PVX、PVM、PVA、PVS、PLRV,23,PPT学习交流,九、延伸阅读,1 吴祖建, 高芳銮, 沈建国. 生物信息学分析实践. 科学出版社, 2010