开题报告(青岛大学)

1、脐带血液间充质干细胞分化为施瓦恩样细胞的Neuregulin-1/ErbB途径的作用发表报告者：圣叶平，余乔和2014年12月，研究现状，雪旺细胞：1，周围神经再生中的重要作用：诱导再生轴突和诱导生长锥的运动方向2、分泌各种神经营养因子(Neurotrophin factors):营养，支持神经细胞的增殖代谢，支持轴突再生和调节髓鞘的形成。Schwann细胞移植：已经有报告称，神经缺损中的Schwann细胞促进神经再生，通过神经缺损到达相应的目标细胞，实现功能恢复的一部分。状态：雪旺细胞来源困难，体外增殖缓慢，很难进入实际临床应用。因此，近年来，对具有多方向分化可能性的干细胞(尤其是成体干细胞

2、)作为供体细胞进行细胞移植治疗的研究越来越受到重视，其中对间充质干细胞(messenchymal stromalcells，MSCS)的研究更成为了热门话题。研究现状，MSCs:来自同一原始胚层的唯一成体多能干细胞，能诱导在特定条件下分化为中胚层来源的心肌细胞、软骨细胞和外胚层来源的神经细胞(神经元和胶质细胞)。特征：MSCs可以自行取材，体外扩增速度理想，因此有望成为Schwann细胞移植治疗的替代细胞。为修复神经损伤的干细胞移植提供了独特的解决方法。状态：1，据报道，MSCs分化为胶质细胞样或神经元等细胞。国内外多支研究小组成功地将MSCs分化为Schwann等细胞，并将分化或未分化的MS

3、CS细胞应用于受损神经修复的研究也获得了良好的功能恢复。2、体外诱导MSCs细胞分化的技术已经成熟，通过维甲酸和巯基乙醇的预诱导，综合应用各种细胞因子、肽等进行分化，生成S-100、GFAP等阳性Schwann样细胞。研究现状，MSC如何分化成像雪旺这样的细胞？目前的观点认为，干细胞分化过程中自身所处的微环境对最终分化命运起着重要作用。也就是说，外来信号可以引导干细胞沿着特定的途径分化为特定的系谱，或者让干细胞选择特定的血统。例如：神经嵴细胞在体内分化为雪旺细胞。神经嵴是多能性细胞，可以在多种环境下分化为肌肉细胞、软骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞等。决定胶质细胞方向的重要因素是早期发育的神经胶

4、质-1、神经胶质-1的神经元表达，施旺前体细胞表达相应的受体ErbB2等，通过神经胶质-1/ErbB信号通路维持施旺细胞前体的存活，施旺研究现状，骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题。1.随着年龄的增长，干细胞数明显减少，增殖和分化明显减少。准备过程不容易质量控制。同种异体移植会引起免疫反应。4.采访时患者有损伤，患者有骨髓病不能采集，即使是健康的捐赠者也不能采集太多骨髓。脐血间充质干细胞的优点：1。保持间充质干细胞的生物学特性2。胎盘和脐带的干燥/祖细胞更原始，增殖和分化能力更强。3.免疫细胞比较幼稚，功能性小，不会诱发免疫反应，不会诱发移植物对宿主病。4.干细胞容易分离，纯度高，没有肿瘤细胞

5、污染。5.采集时产妇和新生儿没有任何伤害或损伤。6.收集方便，保存和运输容易，伦理争议少。研究现状，MSC如何分化成像雪旺这样的细胞？目前的观点认为，干细胞分化过程中自身所处的微环境对最终分化命运起着重要作用。也就是说，外来信号可以引导干细胞沿着特定的途径分化为特定的系谱，或者让干细胞选择特定的血统。例如：神经嵴细胞在体内分化为雪旺细胞。神经嵴是多能性细胞，可以在多种环境下分化为肌肉细胞、软骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞等。决定胶质细胞方向的重要因素是早期发育的神经胶质-1、神经胶质-1的神经元表达，施旺前体细胞表达相应的受体ErbB2等，通过神经胶质-1/ErbB信号通路维持施旺细胞前体的存

6、活，施旺，研究现状，Neuregulin-1:属于表皮生长因子EGF系列的成员与该受体结合，激活受体的酪氨酸激酶活性，从而产生相应的生物学效果。在心血管系统，神经系统的发育过程中起着重要作用。Neuregulin-1基因包含aria(乙酰胆碱受体感应因子)、glial细胞生长因子(GGF)和感觉运动因子(sensolson)Neuregulin-1的受体：主要包含er B2和er B3，Neuregulin-1结合er B2和er B3的二聚体，激活下游通路，从而达到相应的生物学效果。研究现状，神经球蛋白-1/ErbB在Schwann细胞分化过程中的主要作用，Neuregulin-1/ErbB

7、也在向间充质干细胞Schwann样细胞分化过程中起作用吗？1、Dezawa等研究表明，在体外培养的间充质干细胞中，使用Neuregulin-1等因子诱导MSCS分化为S-100阳性Schwann样细胞。2、RT-PCR法检测前一实验中ErbB2的表达。这些都表明Neuregulin-1/ErbB是影响间充质干细胞向Schwann样细胞分化的重要因素。因此，本课题从Neuregulin-1/ErbB开始，探讨间充质干细胞向Schwann样细胞分化的生物学作用。主题思想，1，利用间充质干细胞的体外诱导模型，检测分化过程中神经球蛋白-1及其受体、雪旺细胞相关标记蛋白的表达变化。2、体外分化细胞的功能

8、：培养分化的Schwann样细胞和鳍根神经节，研究分化的Schwann样细胞对鳍根神经节的生物学效应。3、阻断Neuregulin-1/ErbB途径，观察其分化过程和分化细胞功能的影响。4、PI3K/Akt信号传递路径检测。通过以上实验，揭示了Neuregulin-1/ErbB从重质干细胞向施万n等细胞分化过程的作用。实验方法，HUCBMSCs细胞培养和鉴定HUCBMSCs诱导分化和鉴定相关实验预期结果，HUCBMSCs细胞培养和鉴定，1 .脐血间充质干细胞复苏术。2.以10108毫升浓度接种培养基瓶。37，体积分数为5% CO2，放入孵化室培养。(胚胎干细胞培养基：低糖DMEM体积分数10%

9、胎儿血清1%双重阻力)3.7d后第一次水分交换，放弃未附着细胞，此后每3d 1次，用倒置显微镜观察细胞生长。4.原代培养细胞生长到80融合时，用025的胰蛋白酶(GIBCO sa，美国)1: 3传代培养。5 .取第一系结果细胞，用025的胰蛋白酶消化附着细胞，离心洗涤，PBS重悬挂，将细胞浓度调整为1106 /ml。10 uI鼠抗人CD34 1 PE(human mill tenyibioec，美国)、鼠抗人CD45 1 PE(美国)、鼠抗人CD90 1 PE(BD Pharmingen公司，美国)、鼠抗人SI-12 1 Fe，HUCBMSCs细胞培养和鉴定，HUCBMSCs诱导分化和鉴定，1

10、 .第三次转移结果细胞。2.用含有10FBS的LDMEM将细胞悬浮体的浓度调整为61048104ml，将gevotte接种到用细胞攀登精制的6孔培养板中。3 .细胞80融合时，分为系，随机实验组和对照组。诱导方法：1，0.25 mmol/ml-mercaptoethanol乙醇(p，mercaptoethanol，BME，Sigma，美国)，20ng/ml all-tRAns retities2，2天后用具有10FBS的L-DMEM培养物在1日3，3日换成诱导液，1日4，4，5日用具有10FBS的LDMEM培养物在5，6，7日换成具有10FBS的LDMEM培养物，每天用倒置显微镜观察。诱导7

11、d后实验组细胞可有少量死亡。细胞攀登片使用GFAP抗体作为免疫组织化学染色，诱导分化和鉴定HUCBMSCs，分组：1。实验组：正常诱导2。对照组1:LDMEM培养细胞3，含10FBS，无诱导剂。对照组2:诱导培养过程中添加神经调节蛋白-1，ErbB受体抑制剂AG1478，1umol/ml。对照组3:诱导培养过程中，将PI3K抑制剂Wortmannin，1umol/ml添加到分化培养基中。根据各组检测天鹅细胞是否存在：方法1: 7 d后，实验组和对照组的细胞用老鼠进行抗人GFAP单克隆抗体(sigma，美国)，免疫组织化学SP-9 000套件，浓缩DAB套件(北京中石桥生物技术有限公司)，HE染

12、色和SP方法进行GFAP免疫组织用光学显微镜观察细胞质内是否有黄褐色粒子，有黄褐色粒子的细胞是免疫组织培养，随机数1020倍视角细胞数，计算出阳性细胞的比例。使用SPSS 120软件进行统计分析。方法2: 7 d后，实验组和对照组流式细胞术分别检测雪旺细胞的符号蛋白表达。使用SPSS 120软件进行统计分析。方法3:用PCR检测下游途径的重要蛋白质或RNA。没有具体说明，打算寒假结束。如果检测Schwann细胞的存在不足以说明神经调节蛋白-1、ErbB受体、PI3K/Akt信号转导通路的作用，则需要进一步增加神经调节蛋白-1、ErbB受体、PI3K/Akt信号转导通路的核心蛋白质检测。HUCB

13、MSCs诱导分化和鉴定，预期结果-培养结果，1，原代培养：细胞接种2 d后出现一些附着细胞，逐渐突起。4-7 d后产生了大量壁挂细胞，呈圆形或短纺锤形。14 d细胞形态变成长纺锤形。约21 d，梭形细胞融合成单层，充满整个培养瓶。转移到第2、3代后，细胞扩增明显减慢，成纤维细胞和稍宽的扁平细胞，形状类似BMMSCs，再通过继代培养，14 d左右可以融合。预计确认结果：流式细胞术检测，细胞表达表面抗原CD90和SH2，阳性率高；低表达表面抗原CD34和CD45，阳性率低。预计结果-诱导结果，1，诱导7 d后实验组细胞少量死亡。2、方法1检测结果：采用GFAP抗体、S-100抗体的细胞爬壁两组免疫

14、组织化学染色。实验组：细胞免疫组织化学染色呈阳性，细胞素有黄色颗粒，诱导的细胞像23个突起，外形更多的是雪旺细胞(ses wan ncil，sc)肠纺锤形。对照组1:细胞免疫组织化学染色阴性，细胞质蓝色。对照组2:细胞免疫组织化学染色阴性，细胞质蓝色。对照组3:细胞免疫组织化学染色阴性或阳性率极低。3，方法2检测预测结果：实验组：流式细胞术检测，神经调节蛋白-1，ErbB，S-100，p75，GFAP，阳性。对照组1，2，3:阴性。机理研究，上帝与调整后的鸡蛋白-1系表位因子受体(EGF-like receptor，ErbB)相结合，激活ErbB受体酪氨酸磷酸化，以及在细胞分化、增殖过程中起重

15、要作用的下游信号通路。在下游途径中，磷脂酰肌醇-3-激酶/磷酸化蛋白激酶b信号转导途径可能是主要途径之一。该实验用于验证在人类脐血间充质干细胞分化为Schwann细胞的过程中，该途径是否起到了主要作用。多肽因子eg 1:n rg，由Nrg-1基因的编码产物选择性结合体组成。本来是从细胞分化、增殖、生存和迁移实验等不同的生物活动体系中纯化和克隆的，因此有很多不同的名字。例如，acetyl choline receiptor inducing activity(aria)可以刺激肌肉细胞中AChR子单元mRNA的转录，glial growth factor，GGF可以促进同一基因编码的不同连接链Schwann细胞的增殖和存活。NRG-2和nrg-3的其他两个基因可以编码NRG相似因子，但没有明确的生理功能，NRG2、NRG3与NRG1相比只有35%，20%是同源的，但也有相似的蛋白质域。查看NRG的结构。N RG包含相似的域，尽管它们之间有很大的结构差异。免疫球蛋白(Ig)等环结构(loop)，表皮生长因子(EGF)等域，与transmembrane长度不同的细胞内区域域(Fig 1)。机制研究，EGF相似域：NRG和ErbB相结合的NRG的各种结合体的EGF相似域足以介导其受体ErbB相结合，开始一系列生理效应。NRG的EGF相似域、EGF家族生长因子