手性药物分析

1、.,手性药物现代分析方法与技术,盛彧欣,.,什么是手性药物(chiraldrugs),药物的分子结构中存在手性因素，而且由具有药理活性的手性化合物组成的药物，其中只含有效对映体或者以有效的对映体为主。药物的药理作用是通过与体内的大分子之间严格的手性识别和匹配而实现的。,.,手性药物的药效学,两种对映体具有相同或相近的药理活性异丙嗪：抗组胺；普罗帕酮：抗心律失常。一种对映体具有药理活性，另一种活性弱或无活性这类药物只有一种对映体与受体有较强的亲和力，呈活性；另一种作用弱或无活性，为劣映体，这种劣映体相当于杂质。主要包括：非甾体抗炎药物的-芳基丙酸类化合物，如萘普生、布洛芬等。,.,两种对映体药理

2、活性相似，但反应强度不同代表药物：抗癌药环磷酰胺，S-对映体活性是R-对映体的2倍。两种对映体具有不同的药理活性这类药物通过作用于不同的靶器官、组织而呈现不同的作用模式。代表药物：索他洛尔，S-对映体阻断作用R-对映体抗心律失常作用,.,两种对映体的作用相反这类药物的对映体与受体均有一定的亲和力，但通常只有一种对映体具有活性，另一对映体反而起拮抗剂的作用。如：异丙肾上腺素（1-受体激动剂）R-(-)-：受体激动作用S-(+)-：受体拮抗作用一种对映体具有药理活性，另一种具有毒性作用氯胺酮为中枢性麻醉药物，只有(S)-(+)-对映体才具有麻醉作用，而(R)-(-)-对映体则产生中枢兴奋作用。镇静

3、药沙度利胺（反应停），(R)-对映体有镇静作用，(S)-对映体及其代谢产物有严重的胚胎毒性和致畸作用。,.,对映体的作用互补性如：多巴酚丁胺的左旋体具有-受体激动剂作用，对-受体的作用弱，而右旋体为-受体激动剂，而对-受体的作用弱，所以外消旋体给药能增加心肌收缩力，但不增加心率和血压。不同的作用靶点表现不同的特性药物作用于不同的组织（靶点、受体）呈现不同的特性，这类药物往往是多功能的，作用是多方面的。,.,手性药物的药代动力学,吸收被动吸收：手性因素无影响。主动转运和易化扩散：可能发生对映体间的竞争性相互作用和吸收的变化分布手性药物对映体竞争性的与血浆蛋白、酶或受体结合，都可引起对映体间相互作

4、用及其在分布上的改变。,.,代谢相互抑制作用：对映体竞争同一代谢酶，会发生对映体间的相互抑制。单向抑制作用：如果一个对映体是另一个对映体的代谢抑制剂，则会发生单向抑制作用。排泄肾脏排泄的立体选择性主要表现在肾小管分泌、主动转运和肾代谢过程，导致对映体间发生相互作用。,.,随着对手性药物药理活性研究的不断深入，人们已经认识并开始重视手性药物对映体生理作用和代谢过程的差别。特别是1992年美国食品与药品监督管理局（FDA）提出发展单一对映体生产计划和对映体药物纯度的鉴定规定后，如何能快速而准确的分离和测定手性药物已成为医药界关注的重大课题。,.,手性药物的拆分方法,利用物理性质溶解度、吸附力等的差

5、异，如：结晶法、色谱法等；利用反应速度差异的动力学拆分法；利用酶的高度特异性的催化反应的酶拆分法,色谱技术是目前手性药物分离的主要方法,.,手性药物分离常用的色谱技术,高效液相色谱（HPLC）气相色谱（GC）高效毛细管电泳（HPCE）超临界流体色谱（SFC）,.,手性液相色谱法（HPLC）,间接法:手性衍生化试剂法（CDR）首先将对映体经手性试剂衍生，生成非对映异构体后，利用常规HPLC方法分离测定。适于下列情况的拆分：不宜直接拆分的化合物。添加某些基团，增加色谱系统选择性。如：手性脂肪胺类提高紫外或荧光检测的效果。如：采用NBD-(L)-APY荧光试剂柱前衍生化测定布洛芬对映体，提高了检测灵

6、敏度,.,优点：*可采用通用的非手性柱分离；*通过衍生化可提高检测灵敏度；*分离条件简单；*分离效果好。缺点：*要有可被衍生化的基团；*要有高光学纯度的手性试剂；*两个对映体衍生化速率和平衡常数应一致；*衍生化和色谱过程中不能发生消旋化。,.,对衍生化反应的要求手性衍生化试剂具有高的化学和光学纯度，且在贮存中不发生改变手性衍生化试剂和反应产物具有高的稳定性衍生化反应过程中产物不发生消旋化现象待测手性药物具有易于衍生的集团，如氨基、羟基、羧基等反应条件温和、快速、简便衍生化反应生成的非对映体在色谱分离时应能显示高柱效,.,常用手性衍生化试剂,手性羧酸类包括：酰氯、磺酰氯、酸酐和氯甲酸酯类。主要用

7、于衍生手性醇、胺和氨基酸。可与化合物直接缩合，或与样品反应后，合成更有利于拆分与检测的衍生物。手性胺类主要用于羧酸、N-保护氨基酸、醇类等药物的手性拆分。常用试剂有：苯（萘、蒽）乙胺、二甲氨基萘乙胺、对硝基苯乙胺等。异（硫）氰酸酯类易于与大多数醇类及胺类化合物反应而被分离。光学活性氨基酸类广泛用于胺、羧酸及醇类药物，尤其是氨基酸类，其衍生化法基于肽合成原理。,.,直接法在分子间引入手性环境，即采用手性固定相或手性流动相不经柱前衍生化直接分离药物对映体1.手性固定相法（CSP）连接在固定相上的手性识别剂，与药物对映体反应形成非对映体复合物，然后作分离测定。分离的程度和洗脱顺序取决于复合物的相对强

8、度。2.手性流动相法（CMP）向流动相中加入一手性试剂，它与溶质常以氢键、离子键或金属离子的配位键生成非对映体缔合物，从而以常规HPLC固定相分离。3.手性检测器法（CD）,手性液相色谱法（HPLC）,.,优点能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定；除非必须衍生化，否则无需高光学纯度试剂；样品处理步骤简单。制备分离方便，定量分析的可靠性较高；缺点样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂），对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相（包括正相和反相）那样广泛。迄今为止，CSP柱商品已有40多种，价格大多昂贵，尚未有一种具有类似ODS柱的普遍适用性。,手性固定相法

9、,.,手性固定相的类型：刷型手性固定相手性聚合物固定相环糊精手性固定相大环抗生素手性固定相蛋白质手性固定相手性配体交换固定相冠醚手性固定相,.,刷型手性固定相：由一个光学纯的R或S的手性异构体与担体以共价结合而成。手性药物对映体与该手性固定相形成暂时性非对映体复合物，主要包括-作用、氢键作用和范德华力作用。大多使用非极性流动相，适用于正相色谱的分析。可拆分带有烷基、醚基或氨基取代的-给电子芳香化合物的对映体，并能用于制备分离。优点：容易制备，拆分选择性好，柱载量高，已有多种商品化柱缺点：只适用于含有芳香基团的手性化合物的分离。,.,手性聚合物固定相包括纤维素衍生物型、合成聚合物型，主要通过吸引

10、和包合作用实现对映异构体的拆分。可分离烃、酯、醇、酸、酮、酰胺及含磷和硫化合物等。流动相：烷烃-醇混合体系（正己烷-异丙醇）手性聚合物固定相商品主要是日本Daicell公司制造的chiralcel柱。其中chiralcelOD和chiralcelAD柱几乎可以满足常见的85%的手性化合物的拆分，应用广泛。,.,手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用,.,环糊精手性固定相：-、-和-环糊精（CD）是分别由68个葡萄糖单位通过-（1，4）连接构成的环状低聚糖。CD-CSP通过共价键将CD键合到硅胶上，形成对水稳定的键合相。-CD：适合较小的如含单苯基药物的对映体的分析-CD：适用于较大分子

11、药物的分离，如甾体药物或含有稠环的药物。-CD：应用最广。对具有苯环、双环和多取代苯环的手性药物可以实现良好的拆分。如巴比妥类药物和麻黄碱等流动相：含水的反相系统和非水的有机系统均可影响分离的因素：温度、pH、离子强度、流速,.,大环抗生素手性固定相将包含多个手性中心的大环抗生素固定到硅胶上形成了一类用于对映体拆分分析的新型手性固定相。用于手性固定相制备的大环抗生素有：万古霉素、替考拉宁、利福霉素和利托菌素A。,.,蛋白质手性固定相：以离子键（或共价键）和蛋白交联作用将蛋白质固定于硅胶上，利用蛋白质分子与手性化合物分子间的立体选择性作用，进行药物对映体分离，其机理一般有氢键、静电作用、疏水作用

12、、离子对和离子交换等作用。人-酸性糖蛋白（-AGP）：多种类型药物人血清白蛋白（HSA）：多种类型药物牛血清白蛋白（BSA）：适于阴离子型手性化合物，如氨基酸及其衍生物、芳香亚砜和香豆素类等卵黏蛋白（OVM）：用于胺类和羧酸化合物的手性拆分纤维素二糖水解酶（CBH）：适于分离多种类型的碱性药物。,.,手性配体交换固定相通过手性金属配合物与对映异构体作用形成非对映异构体金属配合物而进行手性拆分。主要用于-氨基酸及其类似药物的手性拆分。用于形成金属配合物的离子均为过渡金属离子Cu()、Ni()、Cd(）、Zn（）和Hg（）。商品配体交换柱有ChiralpakWH和WM等。,.,冠醚手性固定相：主要

13、用于一些含有能够质子化的伯胺官能团的手性化合物的分离，尤其是氨基酸及其衍生物对映体的拆分。常用冠醚是“18-冠-6”。一般使用酸性（如高氯酸）流动相。商品柱为日本Daicel公司的CrownpakCR(+)或CR(-)柱。两柱手性拆分的出峰次序相反，可以满足对映体纯度分析时的不同要求。冠醚类化合物有剧毒，有致癌性，试验时必须特别注意。,.,优点：使用常规色谱柱；无需手性试剂衍生；手性添加剂选择范围宽；可在柱后收集到纯异构体缺点：手性添加剂消耗大；手性流动相添加法拆分方法的建立较困难；系统平衡时间长；拆分制备时需分离手性添加剂,手性流动相法,.,常用的手性添加剂：手性离子对试剂在HPLC流动相中

14、加入反离子，使之与流动相中对映体生成非对映的离子对复合物，由于这些离子对复合物具有不同的稳定性和分配性质，在与固定相发生静电、疏水或氢键作用后，产生差速迁移而得以分离。可用于拆分氨基酸类、-受体阻断剂、羧酸及磺酸类等化合物,.,手性配体交换试剂将手性金属配体交换剂加入HPLC流动相中，形成三元非对映体配合物，此配合物与固定相发生立体选择性吸引或排斥反应，由于其结构稳定性和能量的差异，使对映体得以分离。常用的手性配体交换剂为氨基酸及其衍生物与金属离子（Cu、Zn、Ni、Cd等）的配合物。可用于拆分氨基酸及其衍生物、-受体阻断剂等,.,手性亲和试剂具有天然手性性质的蛋白质和胆酸盐可用作HPLC手性

15、流动相法拆分对映体的添加剂。可通过疏水性、静电、氢键和电荷转移等形成类非对映异构体而进行拆分。可拆分氨基酸、羧酸、胺类、巴比妥及-受体阻断剂等。蛋白质手性添加剂还可用于药物-蛋白结合率的测定。,.,手性包合试剂包括环糊精、环糊精衍生物和冠醚。主要利用包合作用在极性流动相中与对映体作用实现拆分。已用于分离氨基酸及其衍生物、巴比妥类、氯胺酮、苯妥英代谢物、美芬妥英及其代谢物、伪麻黄碱、去甲羟基安定、哌嗪类镇痛药等。,.,手性氢键作用试剂药物对映体通过与这类手性的多羰基化合物的分子间氢键作用形成非对映异构体而被拆分。（N-乙酰基-L-缬氨酸-四丁酰胺）拆分氨基酸及其衍生物和巴比妥类药物一般使用低级性

16、的流动相,.,3.手性检测器法（CD）与紫外或示差折光检测器联用，将所用的检测器前后再串联一个旋光检测器即可，使用双通道色谱数据处理机可同时得到两个检测器的结果，通过计算机将两个对映体浓度直接计算出来。适用于各类化合物，专属性好，无须与吸收波长相匹配，不须经手性分离，在手性药物的测定上具有很大的应用前景。,.,手性气相色谱法（GC）,间接法（CDR）先通过共价结合作用，在对映体分子中引入另一个手性中心，形成非对映异构体后，再用常规GC方法拆分。对衍生化试剂的要求试剂具有高的化学和光学纯度试剂与对映体的反应必须迅速而且定量的完成生成的非对映体衍生物必须具有一定的挥发性，以适用于GC分析形成的非对

17、映异构体混合物须有足够大的色谱行为差异形成的非对映体衍生物须具有化学和立体化学的稳定性,.,常用的手性衍生化试剂酰氯类可拆分醇类、胺类薄荷醇酯和脲类可拆分醇类、酯类、胺类异（硫）氰酸酯类可拆分醇、酸类、糖醇类和其他可拆分酸类、内酯类、樟脑、糖,.,直接法（手性固定相法CSP）通过使用一个具有光学活性的环境，即手性固定相，来提供拆分所需要的手性中心。手性固定相的类型：基于氢键作用的手性固定相，主要是氨基酸衍生物固定相基于配位作用的手性固定相基于包合作用的手性固定相，主要是各种环糊精衍生物手性固定相的特点：具有手性识别的立体结构，即至少含有一个手性中心具有低的熔点和高的沸点，以便在较宽的温度范围内

18、使用具有良好的可涂布性能，以便于GC柱的制备,.,基于氢键作用的手性固定相：主要为手性氨基酸衍生物和手性羧酸酯或酰胺聚合物。此类固定相中含有酰胺基或羧酸酯基，可以与手性药物分子中的活泼基团通过氢键作用缔合，形成非对映异构体缔合物。由于立体因素和氢键作用的不同，所形成的非对映异构体缔合物稳定性也不同，导致对映体通过色谱柱所需时间不同，从而实现对映体的分离。对氨基酸、氨基醇对映体具有很好的拆分性能。,.,基于包合作用的手性固定相：主要为环糊精衍生物，可以用于各种类型的易挥发性手性化合物的拆分分析，是手性气相色谱首选的固定相。键合环糊精手性柱的商品有：Chirasil-Dex系列、Chirasil-

19、Dex-TFA系列。,.,基于配位作用的手性固定相：是由过渡金属离子和手性有机配体构成的手性金属配合物。手性金属配合物固定相一般是一价或二价金属离子的配合物。金属离子有铑(Rh)、铕(Eu)、镍(Ni)、锰(Mn)、钴(Co)、铜(Cu)和锌(Zn)等。手性配体主要是一些衍生的萜烯酮，如樟脑酸、薄荷酸和香芹酮等。手性金属配合物固定相一般要求被分析物具有电子或孤对电子，分离机制主要是基于电子相互作用，偶极相互作用也存在。拆分对象主要为低沸点手性化合物，包括烯、醇、醚、酮、酯以及昆虫信息素、香精油等。注：不能使用氢气做载气。氢气的还原性会破坏手性金属配合物。,.,高效毛细管电泳（HPCE）,HPC

20、E：是以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的淌度和/或分配系数的不同而实现分离优点：手性选择剂主要为直接加入，操作简单；手性选择剂消耗少，运行成本低；分离效率高；分离模式多样。分离模式毛细管区带电泳（CZE）毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等速电泳（CITP）毛细管胶束电动色谱（MEKC）毛细管电色谱（CEC）,.,毛细管区带电泳（CZE）基于缓冲液中溶质各自的电泳迁移速率的不同而进行分离通过向背景电解质中添加手性选择剂的方法实现离子型手性化合物的拆分分离。应用最广泛。通过改变运行电解质溶液中手性选择剂的类型和浓度，可以进行分离的最优化。常用的手性选择剂：CD及其衍生物冠醚

21、手性金属配合物大环抗生素蛋白质和糖类,.,毛细管凝胶电泳（CGE）使用添加了手性选择剂的凝胶为分离介质，基于被测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。常用的手性选择剂：CD及其衍生物蛋白质类,.,毛细管等速电泳（CITP）是一种不连续介质毛细管电泳技术，其基本原理是在毛细管电泳中达到平衡后，各区带相随，分成清晰的界面以等速移动并完成分离。在CITP中，要使用两种缓冲液系统，其中一种为前导电解质，充满整个毛细管柱，另一种为尾随电解质，就是将手性选择剂作为前导电解质加入物，加入到缓冲液系统中进行手性拆分。常用的手性选择剂：CD及其衍生物冠醚手性金属配合物大环抗生素蛋白质和糖类,.,毛细管胶束电动电泳（MEKC）是在CZE缓冲液中加入表面活性剂，当溶液