临床检验技能操作

1、实验一、血涂片的制备和染色【原理】 将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。【器材】1载玻片 使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。2推片 选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。3吸耳球。4显微镜。5酒精灯。6

2、采血针。7注射器和针头。【试剂】1瑞氏（Wright）染液（1）液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油密闭保存。（2）液：磷酸盐缓冲液（pH6.46.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可

3、用新鲜蒸馏水代替。2吉姆萨染液 包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。3瑞-吉复合染液（1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。将瑞氏染料和吉姆萨染料置洁净研钵中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3min，共5d，以后存放1周即能使用。（2）液：即磷酸盐缓冲液（pH6.46.8）。包含无水磷酸二氢钾6.64g、无水磷酸氢二钠2.56g，加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000

4、ml。【操作】1采血 （1）静脉采血法：用EDTAK2抗凝12h内的标本，使用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血，直径约4mm。（2）皮肤采血法：选择第三、四手指，并先采红细胞、白细胞计数，再采血1滴置洁净玻片上用于血涂片制备。2制作涂片 左手平执载玻片，或放在类似桌子等平坦地方，右手持推片从后方移动接近血滴，使血液沿推片边缘展开，将推片与载玻片呈3045角，用均匀速度向前将血液推成厚薄适宜的血涂片，血涂片应呈舌状，头、体、尾三部分，且清晰可见。所有血液必须在推片到达末端前用完。推大于一片血片。贫血病人推片速度要快。3干燥涂片 空气干燥：迅速干燥。4标记涂片 在载玻片的

5、一端用记号笔编号，注明患者姓名或门诊/住院号。5染色（1）瑞氏染色法：待血涂片干透后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。然后将玻片平置于染色架上，滴加染液（I液）35滴，使其迅速盖满血涂片，约0.51min后，滴加等量或稍多的缓冲液（液），轻轻摇动玻片或用吸球对准血涂片吹气，使染液充分混合。510min后用流水冲去染液，待干。（2）吉姆萨染色法：将固定的血涂片置于被pH6.46.8磷酸盐缓冲液稀释1020倍的吉姆萨染液中，浸染1030min（标本较少可用滴染）。取出用流水冲洗，待干燥后显微镜检查。（3）瑞一吉复合染色法：操作步骤同瑞氏染色法，只是染色时将瑞一吉复合染液液和液替代瑞氏染液的液

6、和液。6观察结果 将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。观察后显微镜擦拭。【注意事项】 1瑞氏染液 新鲜配制的染液偏碱，染色效果较差，经在室温下贮存一定时间，美蓝逐渐转变为天青B后方可使用，这一过程称染料成熟。放置时间愈久，天青B愈多，染色效果愈好，但必须盖严瓶口，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。甲醇必须用AR（无丙酮）。染液中也可加中性甘油3ml，防止甲醇挥发，

7、使细胞染色较清晰。2采血（1）不能采集以下部位的血液：示指或拇指血液。感染部位血液，如甲沟炎。耳垂部位血液，含单核细胞太多。（2）不能使用肝素抗凝标本。（3）玻片必须清洁、干燥、无尘。新玻片：应在清洁液中浸泡过夜，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。已用过的玻片：应在60清洁液中加热20min，然后用水冲洗，最后用蒸馏水冲洗。边缘破碎、表面有划痕的玻片不能再用。（4）使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。3制作涂片 许多因素可影响血涂片的厚度，针对不同患者应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的患者应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大

8、角度、快推。涂片质量不佳可能原因不规则间断和尾部太长推片污染、推片速度不连续、载玻片太脏有空洞载玻片污染脂肪、油脂白细胞和血小板尾部分布不规则制片技术差涂片太长或太短推片角度不佳涂片没有尾部血滴太大涂片很短血滴太小涂片没有边缘空隙推片太宽有细胞退变现象固定延迟、固定时间太短、甲醇污染血涂片厚血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快白细胞破损推片时用力过猛4干燥涂片 血涂片干透后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。5染色步骤（1）操作注意事项及操作不当的后果见表1-3。操作注意事项操作不当的后果加染液应适量过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲洗，使细

9、胞深染不易检查。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲洗染料沉着在血涂片上冲洗时间不能过久脱色冲洗完的血涂片应立放于支架上剩余水分浸泡脱色（2）染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。冲洗前，应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚，核质是否分明。应该在具体实践中摸索合适的时间，特别是在更换染液时。每批染色液和缓冲液，均需试染，以便掌握染色时间和加缓冲液的比例。6结果观察 低倍镜下观察血涂片应厚薄适宜，细胞不重叠，头尾及两侧有一定的空隙，一些体积大的特殊细胞常在血涂片的尾部出现。如有可能，干燥后的血涂片先用中性树

10、胶封片后再观察，不仅能长期保存血涂片，而且观察效果更佳。染色效果可能原因纠正措施太蓝涂片太厚、冲洗时间太短、中性水pH太高、染色时间太长、稀释染液重复使用、贮存染液暴露于阳光在含1硼酸的95乙醇溶液冲洗2次，用中性水冲洗，待干镜检太红冲洗时间太长、中性水pH太低、贮存染液质量不佳、涂片干燥前加封片规范操作。新鲜配置中性水。保证染液质量不佳太淡染色时间太短、冲洗时间太长复染。应先加缓冲液，后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液染料沉积染料沉淀、染液未过滤、涂片太脏用甲醇冲洗2次，并立即用水冲掉甲醇，待干后复染蓝色背景固定不当、涂片未固定贮存过久、使用肝素抗凝剂注意涂片的固定。使用EDT

11、A抗凝静脉血实验二、白细胞计数及分类计数原理：用白细胞稀释液将血液稀释一定的倍数，同时破坏溶解红细胞。将稀释的血液注入血红细胞计数板，在显微镜下计数一定体积内的白细胞数，经换算即可求出每升血液中的白细胞数量。器材：显微镜、改良牛鲍计数板、试管、吸管、微量吸管、滴棒。试剂：白细胞稀释液操作：1、加稀释液 用吸管吸取白细胞稀释液0.38ml于小试管中。2、吸取血液 用微量吸管吸取新鲜全血或末稍血20ul， 擦去管尖外部余血。将吸管插入小试管中白细胞稀释液的底部，轻轻放出血液，并吸取上层白细胞稀释液清洗吸管23次。3、混匀 将试管中血液与稀释液混匀，待细胞悬液完全变为棕褐色。4、充池 再次将小试管中

12、的细胞悬液混匀。用滴棒蘸取细胞悬液1滴，充入改良Neubauer计数板的计数池中，室温静置23min，待白细胞完全下沉。充两个池双份计数取平均值。5、计数 在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。6、计算：白细胞=41020106=20109/L注意事项：1、稀释用吸管、微量吸血管、血红细胞计数板均为计量工具，使用前需经过严格的校正，否则将直接影响计数结果的准确。2、使用标本可为由静脉搏穿刺采取的新鲜全血，也可为静脉末梢血。采集末梢血时，应注意采血部位不得有冻疮、水肿、发绀、炎症等，以免标本失去代表性；同时也应注意不能过度挤压，以免组织液混入引起血液凝因或造成计数结果不准确。3、在充池时，

13、如充液不足、液体外溢、断续充液，或产生气泡、充液后移动盖玻片等，均会使细胞分布不均匀，造成计数结果不准确。4、计数池内的细胞分布应均匀，一般情况下各大方格间的细胞数相差不超过10%，若相差太大，应重新充池。5、计数大小方格内的压线细胞时，遵循数上不数下、数左不数右的原则。6、白细胞数量过多时，可采用加大稀释倍数的方法，注意区分杂质和白细胞。分类计数：原理：将血液制成细胞分布均匀的血涂片，用瑞氏染液染色，根据各类细胞的形态特点和颜色差异将白细胞进行分类并计数。通常分类100个白细胞，计算得出各种白细胞所占的百分率。器材：显微镜、分类计数器、香柏油、拭镜纸、清洁液。试剂：瑞氏染液、磷酸盐缓冲液操作

14、：1、染色 将血涂片用瑞氏染液染色，冲洗干净，自然干燥后待用。2、低倍镜观察 低倍镜下观察白细胞分布和染色情况。3、油镜观察 选择血涂片体尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域，按一定的方向顺序对所见的每1个白细胞进行分类，并用白细胞分类计数器作好记录，共计数100个白细胞。4、计算 求出各类细胞所占的百分率注意事项：1、由于各种白细胞体积大小不等，体积较小的淋巴细胞在血涂片的头、体部较多，而尾部和两侧以中性粒细胞和单核细胞较多，因此分类最佳区域为体、尾交界处。2、分类时要有秩序地、没一定方向连续地进行，既不重复亦不遗漏，避免主观选择视野。3、分类计数结果的记录也可采用手工画“正”或“+”的方法

15、。实验三、红细胞计数原理：稀释液将血液稀释一定倍数，充入计数池后，在显微镜下计数一定体积内的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量。器材：微镜、改良牛鲍记板、试管、微量吸管、玻璃棒。试剂：细胞稀释液操作：1、加稀释液 取小试管1支，加红细胞稀释液2ml。2、加血 用清洁干燥微量吸管采集末稍血或抗凝血10ul擦去管外余血，轻轻加至红细胞稀释液底部，再轻吸上清液清洗吸管23次，立即混匀。3、充池 混匀后用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放35min，待细胞下沉后于显微镜下计数。4、计数 用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个中方格内的红细胞数。5、计算红细胞/L=N510

16、106200=N1010=100 1012N：表示5个中方格内数得的红细数。 5 ：将五个中方格红细胞数换算成1个大方格红细胞数。10：将1个大方格红细胞数换1ul血液内红细胞数。106：1L=106ul200：为血液的稀释倍数。注意事项：白细胞实验四、网织红细胞计数原理：织红细胞胞质内残存的少量核蛋白体和核糖核酸等嗜碱性物质，在活体染色时可被煌焦油蓝染成蓝色网状或颗粒状，可与完全成熟的红细胞区别。器材：微镜、香柏油、拭镜纸、清洁液、试管、玻片试剂：10g/l煌焦油蓝水溶液，标本新鲜全血。操作：1、加染液 于小试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加入新鲜全血2滴，立即混匀，置室温下

17、1520min。室温不可过低37度。2、制备涂片 取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。3、观察 在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。4、计数 在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。5、计算网织红细胞分数=N/1000网织红细胞绝对值（网织红细胞/L)=红细胞/L网织红细胞分数实验五、红细胞沉降率原理：一定量的枸橼酸钠抗凝全血置于特制血沉管中，直立于特制血沉架上1h后读取红细胞下沉后血浆的高度。器材：魏氏血沉管、血沉架、吸管、试管。试剂：09mmol/L枸橼酸钠溶液，新鲜全血。操作： 1、加抗凝剂 吸取浓度为109mmol/L的枸橼酸钠0.4ml于试管中。 2、采静脉血 取静脉血

18、1.6ml，加入含抗凝剂的试管中，混匀。 3、装血沉管 用血沉管吸入混匀全血至刻度“0”处，拭去管外残留余血。 4、立血沉管 将血沉管直立于血沉架上。注意事项： 1、使用分析纯枸橼酸钠抗凝剂，配制时浓度应准确，配成后液体不浑浊、无沉淀，保存期为2周。 2、严格控制采血量，使抗凝剂与血液比例为14。 3、血沉管内径要标准，放置要垂直，不得倾斜。4、胞在单位时间内下沉的速度与血浆蛋白的量与质，血浆中脂类的量和质，红细胞的大小与数量，是否成串钱相聚以及血沉管的内径、清洁度、放置位置是否垂直，室温高低等因素都有关系。 5、采集时应空腹。 6、血沉的标本要在采集后3h 内测定，并充分混匀。 7、温过低、

19、过高和贫血时，对结果有影响。为此，血沉应尽量放在1825室温下测定。室温过高时血沉加快，可以按温度系数校正。室温过低时血沉减慢，无法校正。实验六、血小板计数原理：液经稀释液按一定比例稀释和破坏红细胞后，充入血细胞计数板内在显微镜下计数一定范围内的血小板数量，经过换算求出每升血液中血小板的数量。器材 微镜，血细胞计数板，采血针，血红蛋白吸管，试管。试剂10g/L草酸铵稀释液。操作：1、吸取稀释液 准确吸取10g/L 草酸铵稀释液0.38ml，置于清洁小试管中。2、采血 常规消毒无名指，穿刺后，让血液自然流出，准确采血20ul，置于含有草酸铵的稀释液中，立即充分混匀。3、稀释静置 待完全溶血后再混

20、匀1min，置室温10min。4、充液静置 取混匀的血小板悬液1滴充入血细胞计数板内，静置1015min，使血小板充分下沉。空气干燥的季节应将血细胞计数板置湿盒内。5、计数 用高倍镜计数血细胞计数板中央大方格内的四角和中央共5个中方格内血小板数量。6、计算 每升血小板数=5个中方格内血小板数109/L注意事项1、草酸铵稀释液要清洁，无细菌、尘埃等污染。存放时间较长后应过滤后再使用。2、毛细血管采血时，针刺应达3mm深，使血液流畅。拭去第1滴血后立即采血，以防血小板聚集和破坏。如果同时做白细胞和血小板计数时，应先采血做血小板计数。3、血液加入血小板稀释液内要充分混匀，但不可过度振荡，以免导致血小

21、板破坏和聚集。4、血小板悬液充入血细胞计数板内需要静置1015min，使血小板完全下沉后再计数。但应注意保持湿度，避免水分蒸发而影响计数结果。5、计数时光线不可太强，注意微有折光性的血小板与尘埃等的鉴别，附着在血红细胞旁的血小板也要注意，不要漏数。6、应在1h内计数完毕，否则结果偏低。7、所用计量器材必须标准化。8、检查前，患者应避免服用含有阿司匹林及其他抗血小板药物。实验七、尿葡萄糖定性检查原理：葡萄糖或其他还原性糖的醛基在热碱性溶液中，能将班氏试剂的蓝色硫酸铜还原为黄色的氢氧化亚铜，进而形成红色氧化亚铜沉淀。器材：试管架、中试管、滴管、试管夹、酒精灯。试剂：1、甲液 枸橼酸钠，无水碳酸钠，

22、蒸馏水加热助溶。2、乙液 硫酸铜，蒸馏水加热助溶。冷却后，将乙液缓慢加入甲液中，不断混匀，冷却至室温后补充蒸馏水至1000ml。如溶液不透明则需要过滤，煮沸后出现沉淀或变色则不能应用。操作：1、鉴定班氏试剂质量 取中号试管1支，加入班氏试剂2.0ml，摇动试管徐徐加热至沸腾，观察试剂有无颜色及性状变化，若试剂仍为透明蓝色，可进行以下实验。2、加尿液 向班氏试剂中加离心后的尿液0.2ml，混匀。3、加热煮沸 继续煮沸12min，或置沸水浴5min，自然冷却。4、判断结果 判断结果见表糖定性试验结果判断反应现象报告方式葡萄糖含量（mmol/L)蓝色不变5.6蓝色中略带绿色,但无沉淀5.611.2绿

23、色,伴少许黄绿色沉淀+28较多黄绿色沉淀,以黄为+2856土黄色浑浊,有大量沉淀+57112大量棕红色或砖红色沉淀+112注意事项：1、试剂与尿液的比例为101。2、煮混时应不时摇动试管以防爆沸喷出，出可在沸水浴中实验。3、检验糖尿病患者尿液中葡萄糖，应空腹或餐后2h留取尿标本。4、尿液中有大量尿酸盐存在时，煮沸后也呈浑浊并带绿色，但久置后并不变黄色而呈灰蓝色，故必须于冷却后观察结果。尿中含大量铵盐时可抑制氧化亚铜沉淀的生成，应加碱煮沸除去。蛋白含量较高时也影响铜盐的沉淀，可用加热乙酸法除去。5、一些非糖还原性物质，如水合氯醛、氨基比林、PAS、阿匹林、青霉素、链霉素、VitC、异烟肼等，当基

24、在尿中含量过高时亦呈阳性反应，应停药3d后再进行检查。对静脉输注大剂量VitC者5d内不宜做尿糖定性，或定性时先将尿液煮沸使之分解破坏。实验八 尿沉渣镜检原理：采用显微镜观察的方法，根据尿液细胞、管型等有形成分的形态特征，识别并记录其在显微镜一定视野内的数量。器材：载玻片、离心机、刻度离心管、盖玻片、滴管、普通显微镜、定量尿沉渣分析板。操作：1、未离心直接涂片法（1)混匀：充分混匀尿液。（2)制备涂片：取混匀的尿液1滴于载玻上，加盖玻片，注意避免产生气泡。（3)观察计数：先用低倍观察全片细胞、管型等成分的分布情况，然后用高倍镜确认。注意使用暗视野观察尿液有形成分，特别是透明管型。管型在低倍镜下

25、观察，至少计数20个视野；细胞在高倍镜下观察至少计数10个视野，取其平均值报告；尿结晶和盐类数量以每一高倍视野、2、3、4报告。计数时要注意细胞的完整性，还要注意有无其他异常巨大细胞、寄生虫虫卵、滴虫、细菌、粘液丝等，男性尿液标本还要注意有无精子及卵磷脂小体。2、离心沉淀涂片法（1)离心尿液：透用于尿外观非明显浑浊的尿标本，是尿沉渣检查标准化推行的方法。取尿液10ml离心5min，要求相对离心力为400g。1500r/ min 离心5min（2)提取尿沉渣：手持离心管倾斜4590，用滴管吸去上层尿液，保留下层0.2ml尿沉渣。（3)涂片：轻轻混匀尿沉渣后，取1滴置载玻片上，用18mm18mm或

26、22mm22mm的盖玻片覆盖后显微镜检查。（4)观察计数：与未离心尿直接涂片法相同。3、定量尿沉渣分析法 定量尿沉渣分析板由1块硬质塑料板制成，每块板内分为10个统一深度的计数池，每1个计数池内的计数区为1.0ul计数区分为10个大方格，每个大方格又分为9个小方格。（1)未离心法：直接取充分混匀的尿液1滴充入定量尿沉渣分析计数池内，在低倍镜下计数10个大方格内管型总数，在高倍镜下计数10个大方格内细胞总数，此即每微升尿液某种细胞或管型的数量。（2)离心法：尿液标本处理同离心尿沉淀涂片法，然后充池计数，方法同上。4、报告结果（1)涂片法：细胞以最低数最高数/HP、管型以最低数最高数/低倍镜视野报

27、告。结晶以所占视野面报告，无结晶为（)；结晶占1/4视野（+)；结晶占1/2视野为（+)；结晶占3/4视野为（+)；结晶满视野为（+)。如果细胞、管理的数量过多难以计算，也可按结晶的报告方式报告结果。（2)定量尿沉渣分析板法：以每微升某种细胞或管型数报告。实验九 尿沉渣定量检查 （一小时尿沉渣计数法） 操作： 1. 标本收集：患者先排尿弃去，准确收集3 h 尿液于干燥容器内送检（标本留取时间5:308 :30）。 2. 准确测量3h尿量，充分混合。取混匀尿液10ml，置刻度离心管中，1500r/min离心5min，用吸管吸弃上层尿液9ml，留下1ml，充分混匀。吸取混匀尿液1滴，注于血细胞计数

28、板内。细胞共数10个大方格，管型共数20个大方格。最终计算出红细胞/h、白细胞/h、管型/h。 注意事项： 1. 尿液应新鲜，PH应在6以下。 2. 尿液比重最好在1.026以上。 3. 如尿液中含多量磷酸盐时，应加少量稀醋酸液（切勿加多），使其溶解；含大量尿酸盐时，应加温使其溶解。 4. 亦可采用尿沉渣定量分析板或尿沉渣自动分析仪进行尿沉渣定量检查，详见有关资料。实验十 本周氏蛋白定性检查 试剂： 1. 200g/L磺基水杨酸溶液； 2. 2mol/L醋酸盐缓冲溶液（pH4.90.1）。 操作： 1. 先将尿液用磺基水杨酸法作蛋白定性检查，如呈阴性反应，则可认为尿液标本中本周氏蛋白阴性。 2

29、. 取透明尿液4ml于试管中，再加入醋酸盐缓冲液1ml，混匀后，放置56水浴中15分钟。如有浑浊或出现沉淀，再将试管放入沸水中，煮沸3分钟，观察试管中浑浊或沉淀的变化，如浑浊变清、浑浊减弱或沉淀减少，均提示本- 周氏蛋白阳性。若煮沸后，浑浊增加或沉淀增多，表明此尿液中还有其它蛋白质，此时应将试管从沸水中取出，立即过滤。如滤液开始透明，温度下降后浑浊，再煮沸时又透明，提示本- 周氏蛋白为阳性。注意事项： 1. 过多的本- 周氏蛋白，在90以上不易完全溶解，故需与对照管比较，也可将尿液稀释后再测。 2. 煮沸过滤除去尿中白、球蛋白时，动作要迅速，并需保持高温，否则本- 周氏蛋白也会滤去。实验十一

30、尿含铁血黄素定性试验 试剂： 120g/L亚铁氰化钾水溶液（用时新鲜配制）； 23 %盐酸。 操作： 1. 取混匀的新鲜尿液15ml，以2000r/min离心5min，倾去上清液。 2. 在沉渣中加入新鲜配制的20g/L亚铁氰化钾水溶液及3%盐酸液各2ml，充分混匀，室温静置10min。 3. 再离心沉淀，取沉淀物涂片，加盖玻片后用高倍镜（必要时用油镜）检查。 4. 如见有分散或成堆蓝色闪光颗粒（直径13um）即为阳性，如在细胞内则更为可信。注意事项： 1. 所有试管、玻片、试剂均应防止铁剂污染，以免出现假阳性。 2. 一般应做阴性对照，如亚铁氰化钾与盐酸混和后即显深蓝色，表示试剂已污染高铁，

31、不宜再用。实验十一 尿乳糜定性检查 【 试 剂 】 1. 乙醚（AR）； 2. 苏丹醋酸乙醇染色液或猩红染色液。 【 操 作 】 1. 取尿510ml，加乙醚23ml，混合振摇后，使脂肪溶于乙醚。静置数分钟后，2000r/min离心5min。 2. 吸取乙醚与尿液的界面层涂片，加苏丹醋酸乙醇染色液或猩红染色液1滴。 3. 镜检观察是否有红色脂肪小滴。 【 注意事项】 1. 尿液中加少量饱和氢氧化钠，再加乙醚，有助于澄清。 2. 将分离的乙醚层隔水蒸干，若留有油状沉淀，也可加苏丹，镜检证实有无脂肪小滴。实验十二 尿胆色素原定性试验 【 试 剂 】 1. 对二甲氨基苯甲醛试剂； 2. 饱和醋酸钠溶

32、液； 3. 氯仿； 4. 正丁醇。 【 操 作 】 1. 在试管中，加入尿标本2ml及对二甲氨基苯甲醛试剂2ml，混合。 2. 立即加饱和醋酸钠溶液4ml，混合，加氯仿3ml，振摇混合后，上层水溶液呈红色者为阳性反应。 3. 阳性结果应用下法证实：如尿胆原含量多，用一次氯仿不能完全抽提尿胆原，应多次用氯仿抽提，直至氯仿层呈淡粉红色或无色为止，再观察上层水溶液色泽。如上层水溶液为红色时，再加正丁醇4ml抽提，如水溶液仍呈红色则证实尿中胆色素元为阳性。 【注意事项 】 1. 醋酸钠溶液必须为饱和液。 2. 当尿胆色素原浓度太高时，应将尿标本稀释25100倍。 3. 尿液必须新鲜，不能久置。实验十三

33、 尿苯丙酮酸定性试验 （三氯化铁法） 【 试 剂 】 1. 100g/L三氯化铁液； 2. 磷酸盐沉淀剂。 【 操 作 】 1. 尿液4ml加磷酸盐沉淀剂1ml，混匀，静置3min，如出现沉淀，可用滤纸过滤或离心除去。 2. 滤液中加入浓盐酸23滴和100g/L三氯化铁溶液23滴，每加1滴立即观察颜色变化。以尿液显蓝绿色并持续24min，为阳性。 【 注意事项 】 1. 尿中若含酚类药物（如水杨酸制剂）及氯丙嗪，也可与氯化铁结合显色，试验前应停用此类药物。胆红素也可造成假阳性。 2. 小儿出生后6 周内不易查出。故于出生6 周后检查为宜。 3. 大多数苯丙酮尿症患者的尿液可出现阳性。但约1/4

34、1/2病例可能会漏检 4. 亦可采用2，4-二硝基苯肼法。实验十四 脑脊液显微镜检查器材：显微镜、改良牛鲍计数板、微量吸管、刻度吸管、小试管。试剂：生理盐水或红细胞稀释液，1%冰乙酸，白细胞稀释液，瑞氏染液或瑞-吉染液。操作：（1)充池：直接用微量吸管吸取混匀的脑脊液，充入血细胞计数板的上下2个计数池。（2)计数：静置23min后，低倍镜下计数2个计数池内四角和中央大方格共10个大方格内的细胞数。（3)计算：10个大方格内的细胞总数即为每微升脑脊液细胞总数，再换算成每升脑脊液细胞总数。 1. 细胞总数： （1）澄清脑脊液：混匀后用滴管直接滴入计数池，计数10个大方格内红、白细胞数，其总和即为每

35、u l的细胞数。（如细胞较多，可计数一大格内的细胞数10）。 （2）浑浊或带血脑脊液：用血红蛋白吸管吸取混匀的脑脊液20ul，加入含红细胞稀释液0.38ml的小试管内，混匀后滴入计数池内，用低倍镜计数4个大方格中的细胞总数，再乘以50即为每ul脑脊液的细胞总数。 2白细胞数： （1）非血性标本：小试管内放入冰乙酸12滴，转动试管，使内壁沾有冰乙酸后倾去之，然后滴加混匀的脑脊液34滴，数分钟后，混匀充入计数池，按细胞总数操作中的红、白细胞计数法计数。 （2）血性标本：将混匀的脑脊液用1%冰乙酸溶液稀释后，按细胞总数操作中的红、白细胞计数法计数，结果稀释倍数。 3细胞分类： （1）直接分类法：白细

36、胞计数后，将低倍镜换成高倍镜，直接在高倍镜下根据细胞核的形态分别计数单个核细胞（包括淋巴细胞及单核细胞）和多核细胞，应数100个白细胞，并以百分率表示。若白细胞少于100个，应直接写出单核、多核细胞的具体数字。 （2）染色分类法：如直接分类不易区分细胞时，可将脑脊液离心沉淀，取沉淀物2滴，加正常血清1滴，推片制成均匀薄膜，置室温或37温箱内待干，进行瑞氏染色后用油镜分类。如见有不能分类的细胞，应另行描述报告。注意事项：1、直接白细胞计数时，也可用微量吸管吸取冰乙酸后尽可能全部吹出，仅使吸管内壁粘附少许冰乙酸，再吸以少量混匀的脑脊液于吸管中，数分钟后吸管内红细胞溶解，然后再充池计数。2、细胞计数

37、时，如发现较多细胞有皱缩或肿胀等异常现象，应如实报告，以协助临床医学鉴别是陈旧性出血或新鲜出血。3、血性脑脊液中的白细胞必须校正后才有价值，校正方法是分别计数血液红细胞、白细胞数和脑脊液细胞总数、白细胞数，扣除因出血而带进脑脊液的白细胞数。脑脊液红细胞数血液白细胞数白细胞校正数脑脊液白细胞未校正数血液内红细胞数4、细胞涂片时，为了使细胞容易粘在玻片上，可取沉淀的细胞悬液2滴，加血清1滴，混匀后涂片。5、涂片染色分类时，如见内皮细胞或异常细胞，则另行描述报告，必要时用巴氏或HE染色查找肿瘤细胞。6、实验结果后，血细胞计数板用0.75%乙醇浸泡消毒60min，忌用酚浸泡，以免损坏计数板。7、细胞计

38、数时，应注意新型隐球菌与白细胞的区别。实验十五 脑脊液蛋白质定性检查原理：脑脊液中球蛋白与苯酚结合，形成不溶性蛋白盐而产生白色浑浊或沉淀。器材：小试管、刻度吸管、尖滴管。试剂：5%饱和苯酚溶液操作：1、加试剂 取试剂2ml于小试管中。2、加标本 用尖滴管垂直滴加脑脊液标本12滴。3、观察结果 在黑暗背景下立即用肉眼观察结果。4、判断结果（1)清晰透明，不呈现云雾状为（)。（2)呈微白雾状，对光不易看见，黑色背景下才能见到（)。（3)灰白色云雾状为（+)。（4)白色浑浊或白色薄云状沉淀为（+)。（5)白色絮状沉淀或白色浓云块状为（+)。（6)立即形成白色凝块为（+)。注意事项：1、当室温在10以

39、下时，应将试剂保存在37温箱中，否则饱和度降低，可致假阳性。2、试管内径以小为佳，一般为（131)mm，加入试剂后立即观察结果。3、标本中如红细胞过多，应离心沉淀取上清液检测。实验十六 浆膜腔积液显微镜检查器材：显微镜、改良牛鲍计数板、微量吸管、小试管。试剂：生理盐水或红细胞稀释液，冰乙酸，白细胞稀释液，瑞氏染液或瑞-吉染液。操作：（一)有核细胞计数1、直接计数法（1)去除红细胞：在小试管内放入冰乙酸12滴，转动试管，使内壁粘附少许冰乙酸后倾去，滴加混匀浆膜腔积液34滴，混匀，放置数分钟，破坏红细胞。（2)充池：用微量吸管取混匀破坏红细胞后的浆膜腔积液充入血细胞计数板的2个计数池内。（3)计数

40、：静置23min后，低倍镜计数2个计数池内四周和中央大方格共10个大方格内的有核细胞数。（4)计算：10个大方格有核细胞总数即每微升浆膜腔积液的有核细胞总数，再换算成每升浆膜腔积液的有核细胞数。2、稀释计数法（1)稀释破坏红细胞：根据标本内有核细胞多少，用白细胞稀释液对标本进行一定倍数稀释，混匀，放置数分钟，破坏红细胞。（2)充池：用微量吸管取混匀稀释后的浆膜腔液充入1个计数池。（3)计数：静置23min后，低倍镜计数1个计数池内的四角和中央大方格共5个大方格内的有核细胞总数。（4)计算：根据5个大方格内的有核细胞总数稀释倍数，计算每升浆膜腔积液的有核细胞数。（二)有核细胞分类1、直接分类法

41、有核细胞计数后，将低倍镜转为高倍镜，直接在高倍镜下根据细胞形态和细胞核形态进行分类，共分类计数100个有核细胞，分别计数单个核细胞（包括淋巴细胞、单核细胞及间皮细胞)和多个核细胞（粒细胞)的百分率。方法基本与脑脊液同，漏出液中有核细胞数量常在100106/L以下；渗出液中有核细胞数量较多，常在500106/L以上。2、涂片染色分类法 在抽出穿刺液后，立即以1000r/min离心5min，取沉淀物制成均匀的薄片，置于室温下或37恒温箱内尽快干燥，瑞氏或瑞-吉染色后油镜分类计数100个有核细胞。一般标本中可见到淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、间皮细胞等。注意事项：1、有核细胞计数应包括间皮细

42、胞。2、必要时可采用细胞玻片离心沉淀仪收集细胞，以提高白细胞分类计数的准确性。3、有核细胞分类计数误差大，尤其是陈旧性、细胞变形的标本，故推荐采用涂片染色分类计数。4、染色分类计数过程中，若发现间皮细胞和不能分类的异常细胞应中外描述或作HE、巴氏染色查找肿瘤细胞。实验十七 浆膜腔积液粘蛋白定性试验原理：浆膜腔上皮细胞在炎症刺激下分泌粘蛋白。粘蛋白是一种酸性糖蛋白，其等电点pH为35，因此，可在稀乙酸中出现白色沉淀。器材：100ml量筒，滴管。试剂：冰乙酸、蒸馏水。操作：1、加试剂 加23滴冰乙酸于100ml量筒中，再加大约100ml蒸馏水，混匀，此时溶液的pH为35，静置数分钟。2、加标本 垂

43、直滴加待测标本1滴于量筒中。3、观察结果 立即在黑色背景下观察有无白色云雾状沉淀生成及其下降程度。4、判断结果（1)阴性、阳性结果的判断。1)阴性：清晰，不显雾状或有轻微白色雾状浑浊，但在下降过程中消失。2)阳性：出现白色雾状浑浊并逐渐下沉至量筒底部不消失。（2)阳性程度的判断1)渐呈白雾状为（)2)可见灰白色雾状为（+)3)白色薄云状为（+)4)白色浓云状（+)注意事项：1、血性浆膜腔积液经离心沉淀后，用上清液进行检查。2、量筒的高度与蒸馏水的量要足够。3、加入标本后立即在黑色背景下仔细观察结果。如浑浊不明显，下沉缓慢，中途消失者为阴性。实验十八 精子活动率和活动力检查原理：精液液化后，将精

44、液滴于载玻片上，显微镜下观察精子的活动情况，计算活动率和活动力。器材：显微镜，载玻片，盖玻片。试剂：5g/L伊红Y染液标本：新鲜液化精液。操作：1、计算精子活动率 取液化精液1滴于载玻片上，加盖玻片，高倍镜下观察100个精子，计数有尾部活动精子数，计算其百分率，即精子活动率。2、观察精子活动力 在观察活动率的同时，观察精子活动的强度，将精子活动分为a、b、c、d四个级别，即精子活动力。a级：精子呈前向快速运动；b级：缓慢或呆滞的前向运动；c级：非前向运动；d级：死精子。3、染色 若不活动精子大于50%，可进行体外活体染色，以鉴别其死活。取新鲜液化精液和伊红Y染液1滴于载玻片上，混匀，1min后

45、推成薄片，自然干燥后于显微镜（高倍镜)下观察。死精子呈红色，活精子不着色。观察100个精子，以不着色精子的百分率报告精子活率。注意事项：1、排精后1h内送检，时间过长，精子活动率和活动力减低。2、检查时注意保温，温度过低，精子活动率、活动力下降。如室温低于10时，应将标本先放入37温育510min后镜检。实验十九 精子计数原理：采用碳酸氢钠破坏精液的粘稠度，甲醛固定精子，然后充计数池，显微镜下计数一定范围内的精子数，换算成每升精液中的精子数。试剂：精子稀释液。标本：新鲜精液化精液。操作：1、取稀释液 取精子稀释液0.38ml于小试管内。2、加精液 加入混匀的液化精液20ul，充分混匀。3、充池 取1滴精子悬液充入计数池内，静置35min。4、观察 高倍镜下计数中央大方格内四角及中央5个中方格内的精子数。以精子头部作为基准进行计数。5、计算精子计数=5个中方格内精子