细菌表面展示技术讲稿(详细版)

1、细菌表面展示（bacterial cellsurface display）技术的发展及应用各位同学大家好，今天我们为大家带来的是：细菌细胞表面展示技术，严谨的科学定义是：指通过重组 DNA 技术，将外源功能蛋白表达并定位于特定细菌细胞的表面，以达到一定的研究与应用目的是一项新的蛋白质应用技术。这句话该怎么理解：一般基因工程需要把蛋白提取出来，最好是菌体可以把蛋白分泌到菌体外，表面展示技术是把目的蛋白表达在细胞表面，外源蛋白的这种表面锚定有4个好处：1.可以使特定的反应在细胞表面直接发生而提高反应效率，2.能克服某些大分子底物不能穿越细胞膜而进入胞内，3客服某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型

2、折叠等弊端，4.使产物的提取纯化过程简化。接下来，我组将从发展史，菌体构建，技术应用，未来展望4各方面为大家介绍。1. 发展史大多数生物技术都是经历了噬菌体细菌真核（酵母菌）的三个发展应用阶段，表面展示技术也不例外。包括：1985年Smith等人创建噬菌体表面展示技术，次年， Freudl 报道细菌表面展示技术，以及近年来兴起的酵母菌表面展示技术与杆状病毒表面展示系统。噬菌体表面展示技术：该展示系统是最早发展起来的,历经20多年发展,现在最常用的噬菌体表面展示系统主要有:丝状噬菌体、K噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体展示系统。噬菌体表面展示技术具有表面展示技术的基本优点,而且技术发展相对成熟,但

3、由于载体自身的限制,使得该展示系统存在着很大缺点。比如,外源蛋白的插入可能影响噬菌体的装配,使其失去感染力;多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合表达时存在不可预测的偏差性等。酵母菌表面展示系统：酵母表面展示系统是近年发展起来的一种重要的真核蛋白表面展示系统。酿酒酵母是具有细胞壁的单细胞真核微生物,是目前常见的酵母表面展示系统载体蛋白来源。根据交配型的差异分为MATa和MATA两种单倍体,其细胞表面分别表达a或A凝集素,它们是酵母细胞壁上的两种甘露糖蛋白,可介导细胞间的性黏附使细胞融合。目的蛋白可分别与a或A凝集素融合,展示于酵母细胞表面。与细菌相比,酿酒酵母在表面展示技术上的应用具有许多优势:(1

4、)具有公认的安全性;(2)其蛋白质折叠和分泌方式与哺乳动物相似,展示哺乳类蛋白优于细菌系统;(3)具有众所周知的发酵特性;(4)展示的蛋白质可通过糖基磷脂酰基醇(GPI)锚定或二硫键绑定在细胞壁上。因此,酵母表面展示系统是一种更为安全、高效的表面展示系统。但该系统也存在一些缺陷,例如酵母生长适温范围窄,主要的蛋白质后加工过程与哺乳动物细胞差异较大,重组酵母缺少选择标记等。2006年有人报道酵母的质量控制系统并不能区分表达完整折叠的蛋白和折叠结构缺陷型蛋白4,这也进一步表明了酵母表面展示系统在蛋白表达上还不完善,筛选出来的蛋白应用前可能还需要进一步分析研究。杆状病毒表面展示系统：属于高等真核生物

5、展示系统。该展示系统以杆状病毒为载体,外源基因插入病毒的衣壳蛋白基因或囊膜蛋白基因后经过加工处理,与衣壳蛋白或囊膜蛋白进行融合表达并在病毒粒子或感染细胞表面进行展示。作为一种真核生物展示系统,杆状病毒表面展示系统允许大片段外源基因的插入,能有效地在病毒粒子表面展示外源蛋白,而且可以对外源蛋白进行糖基化加工和折叠等翻译后修饰,尤其适合需进行特异的翻译后加工才能有效折叠和具有生物活性的高等真核生物细胞表面蛋白和分泌蛋白的展示。目前研究及应用最为广泛的杆状病毒表面展示系统是苜蓿尺蠖核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒表面展示系统5。相对于前几种展示系统,该展示系统可能具有更大的发展和应用空间。2. 细

6、菌表面展示体系的构成细胞表面展示体系通常由运载蛋白（carrier protein）、靶蛋白（又称乘客蛋白，passenger protein）和受体菌三者组成，其中运载蛋白与靶蛋白以融合蛋白的方式交联， 根据运载蛋白与靶蛋白融合位置的不同，一般分为 N 端融合、C 端融合和三夹板式融合等 3 种交联方式。2.1运载蛋白运载蛋白的功能是将靶蛋白引导并锚定于细胞表面特定部位，因此一般应具有以下特性：在结构上具有锚定单元，使靶蛋白能固定在细胞表面；一般具有信号肽或转运信号，藉此引导表达的融合蛋白穿越细胞质膜； 与外源蛋白融合后其本身的锚定特性不发生改变； 展示的靶蛋白不易被胞内蛋白酶降解。 目前已

7、证实多种具有上述特性的细菌细胞蛋白，按其结构部位与功能，可分为细胞膜孔道蛋白、冰晶核蛋白、细胞壁相关蛋白、S层蛋白、细胞表面附属物蛋白和其他类型蛋白等。接下来重点介绍两个应用最广的冰晶核蛋白和我们稍微熟悉的细胞表面附属物蛋白，两个运载蛋白。2.1.1冰晶核蛋白冰晶核蛋白（INP）是存在于丁香假单胞菌等细菌中的一种可诱发生物冰核形成的分泌蛋白， 也是目前应用最为广泛的运载蛋白已从丁香假单胞菌克隆到 inaK、inaV 和 inaZ 等基因均位于染色体上，其编码产物的大小为 1 2001 500 个氨基酸。在结构上，inaK 等基因均为单一开放阅读框，其编码蛋白由 3 个典型的结构域组成：N 端结

8、构域（约占序列的 15），其中含有34 个与膜转移相关的结构单元，但是均未发现有分泌信号序列存在于这个区域中。 此结构域含有较为丰富的 Asp 和亲水性氨基酸 Ser 和 Thr。 Asp 残基可与细胞壁上的糖基磷脂酰肌醇通过N聚糖连接方式进行连接， 而 Ser 和 Thr 残基则可通过 O聚糖连接方式与外膜多糖中的甘露糖相结合，从而将该蛋白锚定固着在外膜表面。 C 端结构域（占 4），其主要的生理功能是参与冰晶形成。中间的疏水结构域（占 81），其序列中周期性地出现 8 个、16 个和 48 个氨基酸残基的重复序列， 其功能主要是起“晶核”的作用而诱导冰晶的形成。 在 C 端结构域和中间疏水

9、结构域也均未发现分泌信号序列。INP 分子结构的这一特征为靶蛋白的转运提供了更多的可行选择。 已报道采用 INP 的 N端加上少数中间重复单元、或仅采用其前 175 个氨基酸残基的N 端，均能有效转运和展示外源蛋白。2.1.2细菌表面附属物细菌表面附属物，如鞭毛和菌毛（性毛）等也可以作为运载蛋白。 鞭毛主要由若干拷贝 FliC 蛋白与其他成分构成，其两端高度保守， 而中间超变区则可以用外源蛋白代替用来构建表面展示体系，同时鞭毛保持原有的功能不变。 但是由于中间超变区的大小有限，插入的外源基因的大小有一定的限制。菌毛是长细丝状的细菌附着物， 由约 1 000 个主要的亚基菌毛蛋白和一些对附着和组

10、装有重要作用的小蛋白组成， 形成一个螺旋筒状结构。 每个细胞含有约 500 个拷贝，菌毛蛋白含有超变区可用于插入靶蛋白。 型菌毛含有甘露糖残基，介导结合到大肠杆菌上皮受体，由于其在细胞表面数量巨大，可产生强烈的免疫反应，具有附着和易于纯化的特性，在疫苗开发和文库构建上具有优势2.2靶蛋白靶蛋白是在细胞内合成后经跨膜转运和在细胞表面固定并展现功能的特定蛋白， 其活性大小直接决定着展示系统性能的优劣。 并非所有内源或外源合成蛋白都适合于用作靶蛋白，一般要求靶蛋白分子内不能形成二硫键或者在发挥活性时需要进行特殊的折叠、 靶蛋白一级结构中带电荷的氨基酸不能对融合蛋白在细胞表面的锚定产生干扰、靶蛋白功能

11、活性区域（如酶的活性中心）的位置通常不能太靠近融合位点等。23 宿主菌宿主菌的遗传背景也是影响展示系统性能的关键因素。 宿主菌应对异源蛋白具有很好的兼容性和较低的蛋白酶降解活性，同时应具有容易培养或某种有利于展示性能发挥的特性，如恶臭假单胞菌的强抗逆性能。 革兰阴性菌是研究较早和目前报道较多的宿主菌，近年也开发了多种革兰阳性菌表面展示系统。3. 技术应用：经历近30年的发展，细菌表面展示技术广泛应用于疫苗开发，蛋白质文库与肽文库的筛选，全细胞催化剂，全细胞吸附剂及降解剂，和其他应用等5个方面。其中蛋白质文库与肽文库的筛选是：从庞大的随机文库中筛选出目标蛋白或肽片段， 对于得到高活性的突变酶或提

12、高抗原决定簇的免疫能力具有重要意义。将靶蛋白展示到细菌表面， 不但可以利用荧光活性分选技术进行筛选，而且直接得到纯化的单克隆。Daugherty 等通过在大肠杆菌表面展示 scFv 和进行点突变建立突变体库， 再使用流式细胞仪分选系统进行筛选， 建立了一种高效筛选突变文库的方法Kim 等采用 DNA shuffling 技术对枯草芽孢杆菌 BSE616 的纤维素酶基因进行改造，建立了大于 1106的文库，通过菌落形态进行筛选，得到的最优菌株的纤维素酶活性比对照高 5 倍采用免疫学技术对大的文库进行筛选具有较高的效率和灵敏性。Bessette 等将 15 个氨基酸的肽插入大肠杆菌外膜蛋白 Omp

13、A上，构建了含有 51010克隆的大文库，通过筛选得到 7 个氨基酸的保守序列，对人血清白蛋白、抗 T7 抗原决定簇、人 C 反应蛋白、HIV1 gp120 和碱性磷酸酶等都有很高的亲和性。近年来， 有关细菌表面展示技术新的应用途径仍然不断出现。 如表面展示技术和固定化技术相结合而开发的生物过滤器，不仅可以从混合的物质中分离出特异的蛋白和抗原决定簇，而且也可以用于生物吸附污水中的重金属， 在水处理和环境监测上具有应用前景。 用表面展示 OPH 的大肠杆菌修饰的 pH 电极， 开发了一种直接测量有机磷神经毒剂的电位式微生物生物传感器。 此外，对将新型纳米技术整合到细菌表面展示的技术也进行了研究，可望促进生物医学工程的发展。4未来展望：近 20 年来， 细胞表面展示技术的应用领域已经大为拓展，但这一技术也存在一些尚未解决的问题，如：目前能够在细菌表面展示的均为一些分子相对较小的蛋白质， 对于超过 500 个氨基酸的蛋白质展示效率很低， 这往往是由于与运载蛋白组建的融合蛋白的跨膜分泌活性较低所致； 目前所展示的主要是一些水解酶类或在结构上无须进行折叠的简单蛋白质， 对于在分子内部有二硫键结构或需要进行折叠的蛋白质往往不能实现功能性的展示； 目前所报道的细菌表面展示系统主要是利用大肠杆菌