酵母发酵产油脂#特选资料

1、参照材料# pHpH对斯达氏酵母发酵生产油脂影响对斯达氏酵母发酵生产油脂影响 摘摘 要要 本论文研究了在摇瓶中利用木薯淀粉发酵生产油脂的培养条件。深入探讨 了 pH 对酵母菌发酵产油脂的影响。在此基础上，主要研究了用 NaOH 和 HCl 调 节培养基不同初始 pH 对斯达氏酵母菌产油和菌体生物量的影响。实验得最佳初 始 pH 后，再向培养基中添加不同浓度的 pH 缓冲剂 CaCO3进行进一步探究。同 时，每批发酵 120h，在此过程中观察培养过程代谢曲线。实验范围内所得酵母 产油的最佳条件是：培养基最佳初始 pH 为 6.0，发酵 120 小时后生物量为 10.58%，油脂产量为 4.01g

2、/L；pH 缓冲剂 CaCO3最佳添加浓度为 2.0g/L，120 小时后生物量为 14.53%，油脂产量 4.91g/L。酵母菌在 24h60h 生物量和油脂 含量快速增长。 关键词关键词： 斯达氏酵母菌；微生物油脂；生长代谢；木薯淀粉；初始 pH 参照材料# Effects of pH on lipid accumulation by Lipomyces starkeyi Abstract Microbial production of lipids and oil-producing yeast growth by cofermentation of cassava starch yea

3、st Lipomyces starkeyi were examined in this paper. When cultivated by shaking flask at 30 and 180rpm for 120h, the influences of the initial pH of culture medium and pH buffer, CaCO3, regulating the pH during fermentation to accumulation was probed. When grown on initial pH of 6.0 under identical co

4、nditions, biomass and lipid content were 10.58% and 4.01g/L,respectively. The best concertration of CaCO3 was 2.0g/L,and the biomass was found as high as 14.53%.In the end, the lipid was 4.91g/L. Through the experimental exploration,the factors influencing the lipid accumulation were investigated an

5、d the optimum conditions of producing lipid were obtained. Keywords Lipomyces starkeyi；Initial pH；microbial lipids；fermentation conditions；Tapioca starch 参照材料# 目目 录录 第第 1 1 章章 绪论绪论.1 1 1.1 引言.1 1.2 微生物油脂简介.1 1.2.1 微生物油脂合成的机理 .1 1.2.2 微生物油脂合成代谢调控.1 1.2.3 微生物油脂研究现状.3 1.2.4 产油微生物优势.3 1.2.5 产油微生物种类.4 1.

6、2.6 产油微生物的培养条件.4 1.3 目的和意义.7 1.4 本课题的主要研究内容.8 第第 2 2 章章 材料与方法材料与方法.9 9 2.1 实验材料与仪器.9 2.1.1 供试菌株、材料及药品试剂 .9 2.1.2 主要仪器与设备 .9 2.2 培养基与培养方法.10 2.2.1 培养基 .10 2.2.2 培养方法 .10 2.3 分析方法.10 2.3.2 菌体浓度的测定 .11 2.3.3 还原糖的测定 .11 2.3.4 总糖的测定 .12 2.3.5 氮含量的测定 .12 2.3.6 菌体细胞的破碎 .14 2.3.7 油脂的提取及定量测定 .14 第第 3 3 章章 结果

7、与讨论结果与讨论.1515 3.1 培养基初始PH 对产油的影响.15 3.1.1 pH 间隔为 0.5 的初始 pH 对产油的影响.15 3.1.2 pH 间隔为 0.2 的初始 pH 对产油的影响.16 3.1.3 pH 间隔为 0.1 的初始 pH 对产油的影响.18 参照材料# 3.2 CACO3的量对产油的影响.19 3.3 培养过程代谢曲线.20 第第 4 4 章章 结结 论论.2626 4.1 结论.26 4.2 展望.26 致致 谢谢.2727 参参 考考 文文 献献.2828 附录附录 A A 译文译文 .3030 附录附录 B B 外文原文外文原文 .4040 附录附录 C

8、 C 原始数据原始数据 .5454 参照材料# 第第 1 1 章章绪论绪论 1.11.1 引言引言 在过去的几年中,由于世界各地的环境污染和能源危机，生物柴油作为一种 可再生、可降解,和无毒的燃料已经受到了越来越多的关注。生物柴油可以通过 可再生的油脂原料经过酯交换反应产生的脂肪酸单酯和高产单烷基酯的长链脂 肪酸与一系列醇而产生。一直都有详细记载，单细胞油脂由一些产油微生物产 生，如酵母、真菌、细菌和微藻。一般来说，酵母和霉菌可比细菌和微藻积累 更多的脂肪1。有资料表明，单细胞油脂利用酶和无机催化作用可以转化为 FAME（脂肪酸甲酯）。除此之外，产油酵母生产的单细胞油脂有许多优点，由 于其生长

9、速度快、高油量和与植物油相似的甘油三酯分数。 1.21.2 微生物油脂简介微生物油脂简介 1.2.11.2.1 微生物油脂合成的机理微生物油脂合成的机理 微生物产生油脂的过程, 本质上与动植物产生油脂的过程相似, 都是从乙 酰 CoA 羧化酶催化羧化的反应开始, 然后经过多次链延长, 或再经过去饱和作 用等完成整个生化过程。在此过程中, 有两个主要的催化酶, 即乙酰 CoA 羧化 酶和去饱和酶。其中乙酰 CoA 羧化酶催化脂肪酸合成的第一步, 是第一个限速 酶。此酶是由多个亚基组成的复合酶,结构中有多个活性位点, 因此该酶能为乙 酰 CoA、ATP 和生物素所激活。去饱和酶是微生物通过氧化去饱

10、和途径生成不 饱和酸的关键酶, 这一过程称之为脂肪酸氧化循环。 综合目前国外的研究,粘红酵母油脂合成的机理可分为四个环节: 两个前体 乙酰 CoA 和 3- 磷酸甘油的形成;甲羟戊酸的合成, 乙酰 CoA 形成脂酰 CoA 和鞘脂; 以甲羟戊酸为前体合成甾醇、 类胡萝卜素和碳水化合物; 以乙酰 CoA 和 3- 磷酸甘油为前体合成磷脂酸、甘油二脂、甘油三脂和磷脂。由此可见, 在酵母细胞内油脂合成的多少, 乙酰 CoA 起了主导作用, 而乙酰 CoA 的形成 又受到氮源多少、 AMP 和异柠檬酸脱氢酶活力等诸多因素的影响。 1.2.21.2.2 微生物油脂合成代谢调控微生物油脂合成代谢调控 微生

11、物高产油脂的一个关键因素是培养基中碳源充足，其他营养成分，特 别是氮源缺乏。在这种情况下，微生物不再进行细胞繁殖，而是将过量的碳水 参照材料# 化合物转化为脂类。首先，当氮源枯竭时，产油微生物的腺苷一磷酸（AMP）脱 氨酶活性增加，AMP 脱氨酶将 AMP 大量转化为肌苷一磷酸（IMP）和氨，相当于 微生物对缺氮的一种应激反应3。通常产油酵母线粒体中异柠檬酸脱氢酶 （ICDH）都是 AMP 依赖性脱氢酶，细胞内 AMP 浓度的降低将减弱甚至完全停止 该酶的活性4。因此，异柠檬酸不再被代谢为 2-酮戊二酸，三羧酸（TCA） 循环陷入低迷状态，代谢路径发生改变。线粒体中积累的柠檬酸通过线粒体内 膜

12、上的苹果酸/柠檬酸转移酶转运进入细胞溶胶中,在 ATP：柠檬酸裂解酶 （ACL）的作用下裂解生成乙酰 CoA 和草酰乙酸。这样，微生物在氮源枯竭、蛋 白质合成停滞的情况下仍可将葡萄糖有效地代谢为乙酰 CoA，并在脂肪酸合成 酶（FAS）的作用下完成脂肪酰 CoA 的合成。 参照材料# 1.2.31.2.3 微生物油脂研究现状微生物油脂研究现状 目前，生物柴油生产主要用动植物油脂作原料，但由于动植物油脂资源非 常有限，限制了生物柴油产业的发展，并且这种方法没有利用获取植物油脂时 伴生的废弃生物质资源。经过科研人员的长期的探索和研究，发现通过微生物 发酵在微生物体内合成的方法制取微生物油脂是一条开

13、发新油源的好途径。微 生物油脂又称为单细胞油脂（SCO），即微生物在一定条件下，利用碳水化合物、 碳氢化合物和普通油脂等作为碳、氮源，在菌体内产生的大量油脂。在适宜条 件下少数产油微生物能将碳水化合物转化为油脂大量贮存，油脂含量最大可超 过其干重的 70%。 到目前为止，虽然日本、英国等国家已有亚麻酸、双高亚麻酸和花生四烯 酸的发酵产品问世，但除亚麻酸外的其他特种油脂目前均未能实现工业化生产。 因此其他脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸还需要人们去努力开发和探索。 随着现代生物技术的飞速发展，研究人员已经将各种生物技术应用于该领 域。如通过对野生菌进行诱变、细胞融合和定向进化等手段获得更高产油能力 或

14、其油脂组成中富含稀有脂肪酸的突变株，提高产油微生物的应用效率。通过 利用现代分子生物学、化学生物学和生物化工技术而获得的最新成果，将加快 对产油微生物菌种筛选、改良、代谢调控和发酵的研究，从而降低微生物油脂 的生产成本，使产油微生物发展更快。 1.2.41.2.4 产油微生物优势产油微生物优势 利用微生物生产油脂，与传统的油脂生产工艺相比较具有许多优点。 （1）微生物细胞增殖快、生长周期短、代谢活力强、易于培养； （2）微生物生长所需原料丰富，且能利用农副产品及食品工业、造纸工业 中产生废弃物，起到保护环境作用： （3）所需劳动力少，同时不受季节、气候变化限制；能精确计划微生物的 量，可连续大

15、规模培养； （4）能连续大规模生产，降低成本； (5)利用细胞融合、细胞诱变等方法，能使微生物产生更能符合人体需要的 高营养油脂或某些特定脂肪酸组成油脂，如 EPA、DHA、类可可脂等。 参照材料# 1.2.51.2.5 产油微生物种类产油微生物种类 常见的产油酵母有:浅白色隐球酵母( Cryptococcus albidus)油脂含量为 65 、 弯隐球酵母( Cryptococcus albidun) 、斯达氏油脂酵母( Lipomyces) 、茁芽丝孢酵母( Trichospiron pullulans ) 、产油油脂酵母( Lipomy slipofer) 、胶粘红酵母( Rhodot

16、orula giutinis) 油脂含量为 72、类酵母 红冬饱( Rhodosporidium toru loides)等。常见的产油霉菌有:土霉菌( Asoergullus terreus)油脂含量为 57 、紫瘫麦角菌(Clavicepspurpurea) 、高梁褶抱黑粉菌( Tolyposporium) 、高山被孢霉( Mortierella alpina) 油 脂含量为 40、深黄被孢霉( Mortierella isabellina)等4。由于利用微生 物生产普通油脂成本太高，还无法和植物油相竞争。因此目前国内外许多科研 单位和高校对产油微生物研究开发的热点主要集中在生产经济价值高

17、的、稀有 的不饱和脂肪酸上如亚麻酸(GLA) 、花生四烯酸(ARA) 、二十碳五烯酸(EPA)、 二十二碳六烯酸(DHA)等。 1.2.61.2.6 产油微生物的培养条件产油微生物的培养条件 （1）木薯淀粉 目前生物柴油的生产成本高是其主要的商品化的障碍。生物柴油的成本高 生产的部分与原材料成本，使其缺乏竞争力的燃料。因此，使用低原材料成本 参照材料# 的关键在降低生物柴油成本生产。为了降低酵母生产油脂的成本，应使用其他 碳源来代替葡萄糖。 木薯是起源与美国的热带根作物同时是热带地区最重要的主食作物之一。 在我国热带地区, 木薯是仅次于水稻、甘薯、甘蔗和玉米的第五大作物。木薯 淀粉是平均链长度

18、为 23 的支链淀粉，其颗粒呈球形或半球形, 平均粒径为 1720 m。通过水解反应，木薯淀粉水解成含有醛基和羰基的淀粉糖，如葡萄 糖、麦芽糖和低聚糖等。 木薯淀粉在淀粉行业常被用作碳源。除此之外，它还以原淀粉和各种变性 淀粉两大类型广泛地应用在食品、饮料、糖果、胶粘剂和胶水、纺织、造纸、 药品及化妆品和生物降解材料等方面。木薯的块根中含 30%的淀粉，而木薯干 含有 70%的淀粉，有“淀粉之王”的美誉5。由于木薯与其他农作物相比有不 可比拟的优势：木薯是非粮食农产品，对土质的要求低, 耐干旱、贫瘠, 符合 “不争粮, 不争( 食) 油, 不争糖, 充分利用边际性土地(不适合种植粮、棉、 油等

19、作物的土地)”的国家粮食发展战略；成本低，具有经济性。因此，作为可 再生的生物质资源，近年来，木薯淀粉在生物燃料的方面得到了广泛的应用与 发展。为减少高温耗能，降低水解成本，本试验选用中温型 -淀粉酶对木薯 淀粉进行水解，进行正交试验优化并确定了酶水解的最佳工艺条件，为木薯淀 粉在生物燃料中的应用提供理论依据。 淀粉的分子式为(C6H10O5)n，是由一薄层蛋白质包裹的存在于植物体的颗粒， 颗粒外层为支链淀粉，内层为直链淀粉。不同来源的淀粉，直链和支链淀粉的 比例各不相同。如玉米淀粉为 2:8；粘质玉米淀粉(Waxy Corn Starches)为 0:10；糯米为 0:10；高链玉米淀粉为

20、7.5:2.5；小麦淀粉为 2.5:7.5；马铃薯 淀粉(Potato starches )为 2:8；红薯淀粉为 1.8:8.2；绿豆淀粉为 6:4。经显 微镜观察，植物品种不同，淀粉颗粒的形态和大小各不相同，其中，马铃薯淀 粉的颗粒直径最大，聚合度也最大 6P。 淀粉不溶于水，在水中随水温的上升而溶胀，然后即破裂而糊化。含有淀 粉的水液，在加热初期仅产生混浊，只有达到糊化温度，才会变成非常粘稠的 半透明液体。在糊化起始温度，淀粉颗粒在偏光显微镜下的“十字”开始出现 模糊，随着糊化进程直至“十字”完全消失。所谓糊化，即是淀粉颗粒的溶胀 参照材料# 和相互接触、晶体结构消失，形成具有粘性的半透

21、明凝胶或胶体溶液的现象。 通常淀粉不显还原性，但它在催化剂（如酸）存在和加热条件下可以逐步水解， 生成一系列比淀粉分子小的化合物，最后生成还原性单糖葡萄糖。 （2） 培养基组成的影响 碳源和氮源的影响： 培养基中碳源和氮源是影响微生物油脂产量的主要因素。微生物高产油脂 就是在培养基中碳源充足而其他营养成分（主要是氮源）缺乏时，微生物菌株 主要将过量的碳水化合物转化为脂类。目前发酵所用碳源主要有葡萄糖、淀粉、 糖蜜和乙醇等。以葡萄糖为碳源时生产的菌体生物量和油脂量可达到最大值。 不同氮源对油脂合成和菌体生长也有影响，氮源主要使促进细胞的生长，只有 在严重缺氮的情况下细胞内才有脂类的积累。赵人峻等

22、研究发现有机氮有利于 细胞增殖，而无机氨源有利于油脂的合成。低碳氮比有利于菌丝体产量的提高 碳氮比则促进菌体细胞内油脂的合成7。 无机盐及微量元素的影响： 无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质，其主要功能是构成菌体成分、 作为酶的促成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养基的渗透压、调节 pH 值和 氧化还原电位等。一般微生物所需要的无机盐为硫酸盐、磷酸盐和含钾、铁、 镁、钠的化合物。微生物对无机盐的需求量很少。但无机盐含量对菌体生长和 代谢产物的生成影响很大。 对真菌而言,适当增加无机盐和微量元素的添加量能提高油脂合成速度和产 油量。长沼等人通过研究油脂酵母发现.增加培养基的铁离子浓度可使油脂

23、合 成速度加快.而增加锌离子浓度可使油脂含量增加。一般来讲.在比生长最适 浓度稍高的盐浓度下油脂会积累，过高就会被阻止。 （3） 培养条件的影响 温度的影响： 温度会影响油脂的含量和组成,菌体通过调节脂肪酸组成来对细胞外温度变 化生适应。霉菌在 30以上较高温度下,适于菌体生长。而在 20以下,利于不 饱和脂肪酸特别是高不饱和脂肪酸的形成，这是因为低温导致细胞膜的流动性 下降，微生物为维持其细胞膜的正常流动性，形成更多的不饱和脂肪酸。 参照材料# pH 值的影响： 微生物正常生长需要一定酸碱度，酸碱度可用氢离子的负对数，即 pH 值来 表示。 PH 的变化会引起各种酶活力的改变,影响菌对基质的

24、利用速度和细胞的结 构,以致影响菌体的生产和产物的合成。PH 值还会影响菌体细胞膜电荷状况， 引起膜的渗透性变化，从而影响菌对营养吸收和代谢产物形成等。因此在了解 发酵过程中各阶段合理 PH 以后，需要进一步设法控制 PH 在合适的范围内。油 脂酵母化培养基的 pH 值越接近中性，稳定期菌体的油脂含量越高。首先要在基 础培养基配方中考虑到维持 PH 的需要，然后通过中间补料来控制 PH。如在青 霉素发酵中，根据产菌代谢需要改变加糖速率来控制 PH。另外，也可通过中间 补加氨水，尿素或硫酸铵，碳酸钙来调节 PH。 通气情况的影响： 通气情况可影响不饱和脂肪酸的形成，因为微生物利用糖类基质合成油脂

25、 及不饱和脂肪酸时会发生去饱和反应，这个过程需要氧。国内对这方面的研究 比较少。 培养时间的影响： 微生物细胞油脂含量随微生物生长阶段的不同而有显著差异。因此培养时 间的长短也有重要的影响，培养时间不足，菌体总数少而影响油脂产量。培养 时间过长，细胞容易变形、自溶，合成的油脂进入培养基中难以收集。因此， 不同微生物的最佳培养时间也时不相同的，如黑曲霉、米曲霉、根霉、红酵母、 酿酒酵母的最佳培养时间分别时 3 天、7 天、7 天、5 天和 6 天。 1.31.3 目的和意义目的和意义 尽管目前对产油微生物 TAG 生物合成和代谢调控机制的研究已取得了重要 进展，但尚未见成功地通过基因调控手段增加

26、细胞内油脂贮存含量的例子。因 此，微生物产油脂领域具有广阔的研究发展空间。随着化石资源日益枯竭和世 界各国能源供应形势日趋严峻，通过微生物转化和利用基于碳水化合物的可再 生资源已成为社会经济可持续发展的迫切要求。应充分利用现代分子生物学、 化学生物学和生物化工技术的最新成果，加快对产油微生物菌种筛选、改良、 参照材料# 代谢调控和发酵工程的研究，降低获取微生物油脂的成本，使微生物产油的研 究领域取得更快的发展。 1.4 本课题的主要研究内容本课题的主要研究内容 本实验主要通过斯达氏酵母菌（Lipomyces starkeyi）进行摇瓶发酵生产 油脂。 以初始 pH 为单因子变量，对照发酵，分别

27、以初始 pH 值、pH 缓冲剂碳 酸钙的量为研究因子，考察其对斯达氏酵母菌发酵产油脂及菌体生物量的影响， 并得到最佳发酵初始 pH、和 pH 缓冲剂碳酸钙的量。查阅文献得斯达氏酵母菌 发酵产油脂及菌体生物量的最佳装液量、最佳接种量、最佳接种时间。 毕业论文的主要研究内容（在摇瓶中进行如下实验）： （1）研究不同初始 pH（5.5、6.0、6.5）对斯达氏酵母菌发酵产油脂及菌 体生物量的影响，并得到适宜 pH。 （2）研究不同初始 pH（若适宜的 pH 为 6.0，则选择 pH 5.6、5.8、6.0、6.2、6.4）对斯达氏酵母菌发酵产油脂及菌体生物量的影响， 并得到较适宜 pH。 （3）研究

28、不同初始 pH（若较适宜的 pH 为 6.0，则选择 pH 5.9、6.0、6.1）对斯达氏酵母菌发酵产油脂及菌体生物量的影响，并得到最佳 pH。 （4）研究初始 pH 为最佳 pH 时，不同的碳酸钙的量 （2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L）对斯达氏酵母菌发酵产油脂及菌体生物量的影响， 并得到最佳碳酸钙的量。 （5）在发酵 0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h，测定实验组 （1）（2）（3）（4）的 pH、总糖、还原糖、氨基氮、菌体浓度、油脂得率等 指标。 （6）对上述各条件和成分于斯达氏酵母产油脂的影响进行分析讨论，观察 分析不同时

29、刻酵母菌产油脂量和菌体浓度有何变化和线性关系。 参照材料# 第第 2 2 章章材料与方法材料与方法 2.12.1 实验材料与仪器实验材料与仪器 2.1.12.1.1 供试菌株供试菌株、材料及药品试剂、材料及药品试剂 （1）供试菌体 斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi AS2.1390），购自中国普通微生物 菌种保藏管理中心（CGM-CC)。 （2）材料 木薯淀粉：由广西伟业淀粉有限责任公司提供 （3）主要药品试剂 臧红 T AR 天津市大茂化学试剂厂 3,5-二硝基水杨 酸 CP 上海科丰化学试剂有限公司 酚酞 AR 天津市大茂化学试剂厂 葡萄糖 AR 江苏强盛化工有限公司

30、磷酸二氢钾 AR 上海化学试剂有限公司 蛋白胨上海强思生化科技有限公司 硫酸铵 AR 上海化学试剂有限公司 硫酸钠 AR 宜兴县第二化学试剂厂 七水硫酸镁 AR 江苏强盛化工有限公司 酵母粉 BR 北京 solarbio 科学技术有限 公司 氢氧化钠（粒） AR 天津市大茂化学试剂厂 甲基红 AR 上海崇明县裕安裕西试剂厂 硫酸 AR 无锡市晨阳化工有限公司 乙醚 AR 无锡市晨望化工试剂有限公 司 甲醛溶液 AR 上海试剂一厂 石油醚 AR 天津市大茂化学试剂厂 丙三醇 AR 江苏强盛化工有限公司 苯酚 AR 天津市大茂化学试剂厂 参照材料# 95%乙醇 AR 无锡市晨阳化工有限公司 无水乙

31、醇 AR 无锡市晨阳化工有限公司 甲醇 AR 天津市大茂化学试剂厂 盐酸 AR 无锡市晨阳化工有限公司 二甲苯 AR 常州市武卫试剂有限公司 苏丹黑 B国药集团化学试剂有限公司 2.1.22.1.2 主要仪器与设备主要仪器与设备 数显式电热恒温水 浴锅 HHS21-8-S 上海跃进医疗器械厂 电子天平 FA2004 上海市恒平科学仪器有限公司 可见分光光度计 722PC 上海欣茂仪器有限公司 奥林巴斯生物显微 镜 CX21 日本奥林巴斯木生式会社 封闭电炉 FD-1 金坛市杰瑞尔电器有限公司 旋转蒸发器 R203 上海申生科技有限公司 循环水多用真空泵 SH2-3 0.097MPa 上海沪西分

32、析仪器厂 真空干燥箱 D2F-6050 上海新苗医疗器械制器有限公 司 双人单面净化工作 台 SW-CJ-2FD 苏州净化设备有限公司 电冰箱 BCD-208K/A CJN 青岛海尔股份有限公司 立式压力蒸汽灭菌 器 YXQ-LS-50S 上海博讯实业有限公司医疗器 械厂 离心机 DL-5-B 上海安亭科学仪器厂 双层培养摇床 SPY50 上海市离心机械研究所 隔水式恒温培养箱 GMP-9050 上海精宏实验设备有限公司 双目生物显微镜 BX51T-32F01- Olympus 日本奥林巴斯木生式会社 2.22.2 培养基与培养方法培养基与培养方法 2.2.12.2.1 培养基培养基 斜面种子

33、培养基（g/L）：葡萄糖 50、磷酸二氢钾 2.5、磷酸氢二钠 0.5、硫酸铵 1、尿素 1、MgSO47H2O 1、酵母膏 0.5、FeSO4 0.1、琼脂 20、 调 pH5.86。 液体种子培养基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 10，蛋白胨 10，pH 自然。 基础限氮发酵培养基(g/L)：葡萄糖 15g，木薯淀粉 55g（木薯淀粉用 1g 淀粉酶水解），(NH4)2SO4 2.5g，酵母粉 0.9g，KH2PO4 1.5g，MgSO47H2O 0.9g 。 参照材料# 2.2.22.2.2 培养方法培养方法 菌株活化，所选原始菌株在固体斜面培养基上划线接种，30恒温培养 5- 6 天

34、。取一管酵母，以无菌水制成菌悬液，去 1mL 均匀接种于液体种子培养基 中，30，180r/min 摇床培养 24h 活化。以 10%（v/v）接种量接种于 50ml 发 酵培养基中，在相同条件下培养 120h。 2.3 分析方法分析方法 实验中参数的测定及分析方法：菌体浓度的测定采用湿菌体法、还原糖的 测定采用 3，5一二硝基水杨酸比色法13、总糖的测定采用苯酚硫酸法14、 氮含量的测定采用甲醛滴定法15、菌体细胞的破碎采用酸热法16、油脂的提 取及定量测定 17、石油醚-乙醚法。 2.3.22.3.2 菌体浓度的测定菌体浓度的测定 湿菌体法： 离心法，空离心管称重（W0），取发酵液 100

35、mL，装在已称重的 2 个离心管 中，装液离心管称重(W1）以转速 4500r/min 的离心机上离心 15min，倒出上清 液，测定固体物重量（W2），计算固体与发酵液的百分比，为菌体浓度（湿重） 。但因为固含物中含有不溶性营养物质，故上述菌浓并非实际菌体的浓度，应 称为相对菌体浓度更合适。 计算公式：菌体浓度 X=(W2-W0)/(W1-W0)*100% W1:沉降物与离心管重量，g W0：离心管重量，g 2.3.32.3.3 还原糖的测定还原糖的测定 3，5一二硝基水杨酸比色法： （1）试剂：DNS(3，5二硝基水杨酸)比色法所用试剂 3，5二 硝基水杨酸溶液:准确称取无水的 3，5二硝

36、基水杨酸 6. 5 g 溶解待用， 无水氢氧化钠 40. 0 g 溶解后移入 500 ml 容量瓶，冷却后定容。将水杨酸移入 1000 ml 容量瓶中并加入 325 ml 氢氧化钠，再加入 15 ml 丙三醇溶解定容至刻 度，摇匀后储存于棕色试剂瓶中。以上试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 （2）DNS 比色法绘制标准曲线： 参照材料# 用移液管准确吸取 0，0. 1，0. 2，0. 3，0. 5，0. 7，0. 8 ml 0. 1%葡 萄糖标准液分别置于试管中，用蒸馏水补充至 1 ml，加 3，5二硝基水杨 酸溶液 1 ml，摇匀，置沸水中煮 5 min，迅速取出以流水冷却，加蒸馏水至 10 ml

37、，用只加入蒸馏水的试管空白调零，选用分光光度计在 520 nm 波长处测定吸 光度值，整个测定过程控制在 2 h 内，并且显色 20 min 后测定。以吸光度值作 纵坐标，葡萄糖标准系列中葡萄糖含量(ug)作横坐标，绘制标准曲线: y=1.8271x-0.0261。 （3）样品测定：将待测样品稀释至测定范围内(5160ug/ml)，用移液管 吸取样液 1 ml，加 3，5二硝基水杨酸溶液 1 ml，以下同标准曲线的绘制 方法。 计算公式： 待测液浓度= （OD520+0.0261）/1.8271 式中，OD520：样品在 520nm 处吸光值。 2.3.42.3.4 总糖的测定总糖的测定 苯酚

38、一硫酸法： (1) 原理 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生 成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 (2)溶液的配制 浓硫酸：分析纯 5苯酚：称取 5.00 克苯酚(分析纯重蒸馏试剂)，加水在烧杯重使之溶解 至 100g，移入棕色瓶中密封，可置冰箱中避光长期保存。 标准葡萄糖：将无水葡萄糖于 105烘干至恒重。 (3)标准曲线的绘制及样品的测定 制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖 20mg 于 500ml 容量瓶中，加水至刻度， 摇匀。分别吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 及 1.8ml，各补水至 2.0 ml，然后加

39、入 5苯酚 1.0ml 及浓硫酸 5.0 ml，静置 10 分钟，摇匀，室温放置 20 分钟后于 490nm 处测光密度，以 2 ml 水同样显色操作为空白，横坐标为糖 微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线：y=0.0146x+0.0071。 参照材料# 样品含量测定：将样品准确稀释合适的倍数，吸取1.0ml溶液，测量其光密 度值，使光密度值恰好在0.3左右(即相当于稀释的样品1.0ml中含有40微克的多 糖。按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线即可计算样品中多糖含量。 计算公式： 待测液浓度= （OD490-0.0071）/0.0146 式中，OD490：样品在 490nm 处吸光值。 2.

40、3.52.3.5 氮含量的测定氮含量的测定 甲醛滴定法： 因为蛋白质的最终水解产物是氨基酸，氨基酸是两性电解质，在水溶液中 有如下平衡： NH3是弱酸，完全解离时 PH 为 1112 或更高，若用碱滴定NH3 所释放 的 H来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于 10，很难准确指示滴定终点。 常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物，使上述平 衡右移，促使NH3释放 H，使溶液的酸度增加，滴定中和终点移至酚酞的变 色域内（PH9.0 左右）。因此可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。 如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如 样品为多种氨基酸的混合物如蛋白

41、质水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定 量依据。但此法简便快速，常用来测定蛋白质的水解程度，随水解程度的增加 滴定值也增加，滴定值不再增加时，表明水解作用已完全。从消耗的碱量可以 计算出氨基氮的含量。 参照材料# 取上清液 2mL 于磨口具塞锥形瓶中，加 5mL 蒸馏水（对照组加 7mL 蒸馏水） ，然后向三个瓶中各加入 2 滴溴酚蓝和 4 滴酚酞指示剂，混匀后各加 5 ml 中性 甲醛溶液再混匀，分别用 0.1mol/L 标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。 重复以上实验两次，记录每次每瓶消耗的标准氢氧化钠溶液的毫升数。 氨基氮计算： （V未V对） NNaOH14.008 氨基氮（毫克/毫

42、升）= 2 公式中 V未为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。V对为滴定 对照液耗用标准氢氧化钠溶液的平均毫升数。NNaOH为标准氢氧化钠溶液的摩尔 浓度。 2.3.62.3.6 菌体细胞的破碎菌体细胞的破碎 酸热法： 该方法和目前已应用于工业化生产的胞壁破碎法(如高压匀浆法, 珠磨法和 超声波法等)相比具有以下特点:操作简便, 不受实验室特殊设备条件的限制； 成本低, 破碎效果较好, 细胞破碎率可达到 80%；酸、热处理细胞比较平和, 对内溶物分子破坏性小。 向上述离心后的菌体沉淀加入 10ml4MHCL，浸泡 1h，转移入 250ml 三角瓶 中，煮沸 10min，流水冷却后放入

43、4冰箱中 30min。 2.3.72.3.7 油脂的提取及定量测定油脂的提取及定量测定 石油醚-乙醚法： 将菌液冷冻 30min 后取出，加入 15ml 石油醚，震荡，再加入 15ml 乙醚， 震荡，3500r/min 离心 15min，可见明显分层。用胶头滴管小心吸取上层有机 相于 25ml 蒸发瓶中，旋转蒸发仪蒸至恒重，置 80烘箱 2h，冷却后称重，得 油脂产量（g/L）。 参照材料# 第第 3 3 章章结果与讨论结果与讨论 3.13.1 培养基初始培养基初始 pHpH 对产油的影响对产油的影响 微生物正常生长需要一定酸碱度，酸碱度可用氢离子的负对数，即 pH 值来 表示。每种微生物都有

44、自己的生长最适 pH 值，微生物生长的最适 pH 值和发酵 的最适 pH 值往往不一定相同。在发酵过程中，控制适当的 pH 值是非常重要的 工作。在发酵过程中 pH 值变化决定于微生物种类、基础培养基的组成和发酵条 件，在菌体代谢过程中，自身有造成其生长最适 pH 值的能力，但是外界条件发 生较大变化时，pH 值将会不断波动。培养基的初始 pH 是影响微生物发酵的一 个重要因素，因为它不仅会影响菌体的生长，而且也会影响到菌体内油脂的积 累。 3.1.13.1.1 pHpH 间隔为间隔为 0.50.5 的初始的初始 pHpH 对产油的影响对产油的影响 表 1 培养基初始 pH 对斯达氏油脂酵母生

45、长和产油的影响（pH 间隔为 0.5） Table.1 Effects of initial pH on growth and lipid accumulation of Lipomyces starkeyi (pH interval 0.5) Initial pH Reducing sugar (g/L) Residual sugar (g/L) Biomass (g/100ml) Yield (g/L) 5.01.4422.877.720.51 5.51.2022.148.511.92 参照材料# 6.00.5719.309.096.12 6.50.6813.3710.732.89 7.0

46、0.6617.6111.162.23 固定接种量为 10，基础发酵培养基用稀 HCl 或稀 NaOH 调节初始 pH 分别 为 5、5.5、6.0、6.5、7.0，于 30，180r/min 摇床培养 120h 进行发酵，发 酵结束后测量菌体生物量、油脂产量和总糖等，试验结果见表 1。 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 5.05.56.06.57.0 培养基初始pH 生物量(g/100mL)/油脂量（g/L） 生物量 油脂量 图 1 培养基初始 pH 对斯达氏油脂酵母生长和产油的影响（pH 间隔为 0.5） Fig.1 Effects of initia

47、l pH on growth and lipid accumulation of Lipomyces starkeyi (pH interval 0.5) 由图 1 可知，这说明斯达氏油脂酵母可以在一定的 pH 范围内生长和积累产 物油脂，发酵培养基适宜初始 pH 值为 6.0，在此条件下生物量和油脂含量分别 达到 90.9 g/L 和 6.12g/L，这说明在偏中性条件下对菌体生长和油脂积累有明 显的促进作用。当培养基初始 pH 为 7.0 时，生物量达到最大，但油脂积累并没 有达到最大值，这说明菌体生长和生产油脂的最适 pH 并不相同，所以在发酵过 程中控制 pH 对菌体生长和油脂积累有很

48、大的影响。 初始 pH 为 5.5 时，菌体生物量和油脂产量分别为 85.1g/L 和 1.92g/L，初 始 pH 为 6.0 时，菌体生物量和油脂产量分别为 90.9g/L 和 6.12g/L，初始 pH 为 6.5 时，菌体生物量和油脂产量分别为 107.3g/L 和 2.89g/ L，pH 间隔为 0.5 时，菌体生物量和油脂产量差别很大，所以 pH5.5，6.0，6.5 之间的间隔 范围太大，需要缩小 pH 间隔范围，进一步进行试验，确定最佳初始 pH 值。 参照材料# 3.1.23.1.2 pHpH 间隔为间隔为 0.20.2 的初始的初始 pHpH 对产油的影响对产油的影响 固定

49、接种量为 10，基础发酵培养基用稀 HCl 或稀 NaOH 调节初始 pH 分别 为 5.6、5.8、6.0、6.2、6.4，于 30，180r/min 摇床培养 120h 进行发酵。 发酵结束后测量菌体生物量、油脂产量和总糖等，试验结果见表 2。 由表 2 可知，发酵培养基较适宜初始 pH 值为 6.0，在此条件下生物量和油 脂含量分别达到 87.9 g/L 和 5.86g/L，这同样说明在偏中性条件下对菌体生长 和油脂积累有明显的促进作用。 表 2 培养基初始 pH 对斯达氏油脂酵母生长和产油的影响（pH 间隔为 0.2） Table.2 Effects of initial pH on

50、growth and lipid accumulation of Lipomyces starkeyi(pH interval 0.2) Initial pH Reducing sugar (g/L) Residual sugar (g/L) Biomass (g/100ml) Yield (g/L) 5.61.0721.488.421.96 5.81.0520.149.014.52 6.00.6419.438.795.86 6.20.8731.799.054.66 6.40.6922.4510.553.51 当培养基初始pH为6.4时，生物量达到最大，但油脂积累同样没有达到最大 值，初始pH为5.8时，菌体生物量和油脂产量分别为90.1g/L和4.52g/L，初始pH 为6.0时，菌体生物量和油脂产量分别为87.9g/L和5.86g/L，初始pH为6.2时， 菌体生物量和油脂产量分别为90.5g/L和4.46g/L，pH间隔为0.2时，菌体生物量 和油脂产量差别也很大，所以pH5.8，6.0，6.2之间的间隔范围太大，需要缩小 pH间隔范围，进一步进行试验