《微生物限度检验》PPT课件

1、1.微生物限度检查方法验证，2007年4月和2007年2月，微生物限度检查：指对非无菌制剂、原料和辅料的微生物污染的检查。包括：1)细菌计数；2)霉菌和酵母计数；3)对照菌检查：大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌群、3、细菌、霉菌和酵母菌计数、4、对照菌检查(EP)、5、对照菌检查(USP)、6、对照菌检查(中国药典05版)、7、05版微生物限度检查法与英美对照、8、验证目的，-是确认(发现)一种有效的检测方法，如果样品(药物)中有一定数量的微生物，则该方法可用于检测样品(药物)中的微生物。-充分验证样品(药物)本身对微生物生长的影响。9、验证目的，确认试验方法。验证试验方

2、法的试验条件、样品量、稀释剂类型、稀释剂体积、中和剂培养基培养时间、培养温度.SOP、试验程序、10、影响微生物试验的因素、样品/药物本身的特殊性、添加到样品/药物中的防腐剂/抑菌剂、培养基的特性、培养条件、人员因素、试验设备的选择、11、回收试验、微生物方法验证的本质是评估和检查微生物回收试验(回收增长)的可信度。-恢复试验是为了确认某种试验方法，这种方法可以使添加到其中的各种微生物恢复生长。验证内容(1)计数方法的验证(2)对照菌检验方法的验证(13)微生物限度检查方法的验证(1)计数方法的验证(14)供试品溶液的制备(中国药典2005年版)-表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效且不影

3、响微生物的生长和存活。-从制备到添加测试介质，测试溶液不得超过1小时。-如果制备测试溶液需要水浴，温度不得超过45。-测试溶液的体积：100毫升。15、稀释液(中国药典2005年版)，(1)氯化钠-蛋白胨缓冲液(1)pH7.0 (2)无菌磷酸盐缓冲液(2)pH6.8 (3)无菌磷酸盐缓冲液(3)pH7.6固体：10g样品稀释液至100ml液体：10ml样品稀释液至100ml，16、微生物计数法验证菌种选择原则，普适性-G，G-，-杆菌(长短杆菌)-球菌-真菌(丝状真菌，酵母)-特殊性-从环境中分离的常见杂菌-从菌株名称CMCC编号培养条件大肠杆菌cmcc (b) 44102金黄色葡萄球菌cmc

4、c (b) 26003枯草芽孢杆菌cmcc (b) 63501白色念珠菌cmcc (f) 98001黑曲霉CMCC(F)98003，营养肉汤培养基在30-35下培养18-24小时，改良马丁培养基在20-25下培养18-24小时，改良马丁斜面培养基在20-25下培养5-7天，10-25天用于微生物计数方法验证的菌株：USP29版。菌株名称ATCC数培养条件大肠杆菌(ATCC 873932)2.5ATCC葡萄球菌653832 2.5铜绿假单胞菌ATCC902732 2.5生孢梭菌ATCC 1143732 2.5枯草芽孢杆菌ATCC 663322 2.5念珠菌ATCC1023122 2.5黑曲霉AT

5、CC 1640422 2.5，计数方法验证步骤19，细菌100cfu/ml霉菌，酵母100cfu/ml，22，回收试验原理，样品抑菌消除-处理方法和样品试验方法不应影响样品中微生物的生长，23，如何消除抑菌活性，稀释法-中和法-离心法-膜过滤法-联合应用，24，计数法验证(平板法)，样品组：样品溶液(1/10)9.9mll104cfu/ml细菌悬液0.1ml稀释液对照组：蛋白胨稀释液9.9m样品组和稀释液对照组的微生物计数结果一致，表明：-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌作用。2.稀释液对照组和菌株组的微生物计数结果一致，表明：-中和剂无毒性，不影响试验菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试

6、细菌的生长。3.空白样品组测试结果为阴性，表明：-测试样品合格。-无菌操作正确。没有发生污染事件。26，可接受的标准平板法，1，良好的再现性-三个不同批次的样品/产品-三个独立试验2，验证数据合理有效(微生物回收率)-阴性对照：发生无污染事件-样品组(回收率):A=C30%(偏差 30%)，3，样品处理方法和试验方法与试验程序一致，27，计数方法的验证-国家药典结果判断标准，美国药典：所有试验细菌的回收率不低于70%。极谱法、BP法和JP:的回收率均不低于80%。中国药典2005年版：各试验菌(包括试验样品组和稀释液对照组)回收率不低于70%。28，不可接受的标准：1。阴性对照：阴性对照(包括

7、蛋白胨组和空白样品组)有污染事件。菌落鉴定：-受污染的细菌是测试细菌：对检查员进行无菌操作培训。-受污染的细菌不是测试细菌：偏差调查。2.阳性对照：样品组的测试数据不符合检测限。(微生物回收率过高或过低)结论：样品组检测结果无效。重新开始细菌恢复测试，直到达到检测极限。29，不可接受的标准：3，样品组：-三个人的测试结果应与检测极限一致。-第一次测试的结果应由第二次和第三次测试确认。-任何与测试极限不一致的结果表明测试过程有缺陷，需要再次进行验证。30，优化更新步骤：消除抗菌活性。稀释样品时，应确认测试极限(测试极限)低于或等于标准。不同的细菌，从不同的稀释度可以检测出好的结果，最高的稀释度将

8、用于日常监测。31，平板法优化更新方法：稀释样品：1/101/501/100，增加培养基量，延长培养时间，加入抗活性剂，32，计数法验证(膜过滤法)，样品组：10毫升样品溶液(1/10)过滤器5x102cfu/ml细菌悬液0.1毫升蛋白胨对照组：10毫升蛋白胨稀释液过滤器(阴性对照)5x102cfu/ml细菌悬液0.1毫升细菌组：5x102cfu/ml细菌良好的再现性-三批不同批次的样品/产品-三次独立测试2。验证数据合理有效(微生物回收率)-负控制：无污染事件。-样本组：B=A 30%(偏差 30%)。3.样品处理方法和检验方法符合检验程序。34.膜过滤方法得到优化和更新。增加洗涤量，增加样

9、品的稀释倍数(1/50，1/100)并延长培养时间。添加抗活性剂(也可以添加洗涤剂)。35.微生物检验方法验证。(2)控制细菌检验方法验证。36.控制细菌检验方法验证菌株选择原则。给药途径和样品类型决定了采用哪种控制细菌检查验证。37.富集培养基的测定。富集培养基的实际量等于v所用的量38、对照菌检验方法验证，选择一种方法：CP或USP设定检验限：不得检测设计验证方案，39、对照菌检验方法验证(平板法)(以大肠杆菌为例)、增菌(计数)、样品组、蛋白胨对照、菌悬液对照、100毫升增菌液大肠杆菌悬液0.1毫升、1X 102厘泊/毫升、大肠杆菌悬液0.1毫升、1X 102厘泊/毫升、蛋白胨100毫升

10、增菌液大肠杆菌悬液0.1毫升、1X 102厘泊/毫升、培养对照细菌试验方法验证(平板法)(以大肠杆菌为例)，培养确认后，应检查大肠杆菌菌落形态并进行显微镜检查，必要时应进行鉴定。 4组试验样品，观察，CP法，USP法，18小时，24小时，41，结果判断依据：1，样品组和蛋白胨对照组的试验结果一致，表明：-加入的中和剂完全消除了样品的抑菌作用。2.蛋白胨对照组和菌株组的试验结果一致，表明：-中和剂无毒，不影响试验菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试细菌的生长。3.空白样品组测试结果为阴性，表明：-测试样品合格。-无菌操作正确。没有发生污染事件。42，可接受的标准，1，样品检验-培养后的富集肉

11、汤明显混浊-分离平板上出现典型的大肠杆菌菌落2，阳性对照-培养后的富集肉汤必须混浊-分离平板上出现典型的大肠杆菌菌落3，阳性细菌计数-细菌悬液的计数结果应为100cfu，43，不可接受的标准(无效试验)，1。样品检验-不符合可接受的标准结论：重新设计测试步骤2，阳性对照-不符合可接受的标准结论：重新测试3，阳性细菌计数-不符合标准结论：重新打开大肠杆菌回收试验，并制作新的细菌悬液，直至其符合要求。44、优化控制菌验证步骤：将富集液的体积扩大100 ml、200 ml、300 ml、400 ml、500 ml，并通过膜过滤法加入活性试剂来延长富集液的培养时间、45、控制菌验证法(膜过滤法)(以大

12、肠杆菌为例)，向膜过滤器中加入10ml稀释液，对过滤器进行加湿。向薄膜过滤器中加入100毫升样品富集液。将0.1毫升、5102毫升大肠杆菌悬液加入到膜滤器中，用稀释剂冲洗，使膜上出现50个菌落。46、验证失败(无效试验)，1、样品中某些成分是固有抑菌成分2、参考防腐实验/验证数据3、参考样品中各成分的理化性质，47、验证结果，根据验证结果，判断是否符合验证标准。-符合验证方法和条件，继续进行药物微生物限度检查；-不符合重新设计验证方案，然后验证，直到所有验证结果符合验证方案。1.所有验证工作必须按照批准的验证方案进行。2.验证计划批准后，可以进一步修改，但必须在验证报告中注明。3.验证后，验证

13、数据记录和验证报告应同时发布。4.最终样品的稀释和方法必须在标准操作程序中说明。49、通过膜过滤的测试物品，(1)水溶液(2)水溶性固体制剂(3)-内酰胺抗生素水不溶性制剂(1)可溶于肉豆蔻酸异丙酯和粘稠油的糊剂(2)充满药物的无菌气体(喷雾)注射器(3)带有导管的医疗器械(输血、输液袋等。)，50、方法验证的关键点(1)，对于相同的培养物，采用相同的测定方法，不同实验室人员的测定结果可能有较大误差，甚至达到50%。因此，在操作过程中，应特别注意所有可能导致错误的环节。51，方法验证的关键点(2)，当使用固体培养基上的培养物制备细菌悬液时，细菌苔应尽可能充分分散在稀释剂中的单个菌体中，并且通常细菌苔和微量稀释剂应首先在管壁上均匀混合。对于那些不易制成均匀细菌悬液的细菌性肝脏(如枯草芽孢杆菌)52、方法验证的关键点(3)，为了保证每次细菌计数测定都能在预期范围内，当菌液以