酶标仪（培训课件）

酶标仪酶免疫分析是基于酶催化反应的特性来进行检测和定量分析免疫反应。在实践上，首先要让酶标记的抗体或抗原与相应的配体（抗原或抗体）发生反应，然后再加入酶底物。酶催化反应发生后，可通过检测下降的酶底物浓度或升高的酶催化产物浓度来达到检测或定量分析抗原抗体反应的目的。一、酶免疫分析的基本原理酶是一种能催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有的人造催化剂，一般可使反应加速108一1010倍。此外，酶还具有高度的专一性，即每一种酶只催化一种或一组密切相关的化学反应。免疫技术是利用Ag-Ab反应进行的检测方法，特点是具有高度的特异性和敏感性。如将Ag或Ab用标记物(如荧光素、酶、放射性同位素等)进行标记，则在与标本中的相应Ab或Ag反应后，可以不必测定Ag-Ab复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。

EIA是将酶催化的放大作用与抗原、抗体的免疫反应相结合的一种微量分析技术。酶标记抗体或抗原后，既不影响抗体或抗原的免疫反应特异性，也不改变酶本身的催化活性，即在相应的反应底物参与下，标记的酶可以使底物基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型转变为有色的氧化型，这种有色产物可以通过肉眼、光学显微镜或电子显微镜进行观察，也可以用分光光度计加以测定。呈色反应显示了反应体系中酶，即被标记的抗体（或抗原）的存在，从而证明发生了相应的免疫学反应。因此，EIA是一种特异而敏感的检测技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，也可以在微克、甚至纳克水平上对其进行半定量、定量测定。二、酶免疫分析方法中的主要组成部分

（－）固相载体非均相EIA免疫实验所用的固相载体应具备以下条件：①可结合抗体（抗原）的容量大、种类多；②可将抗体（抗原）牢固地固定在其表面，虽经长期保存和多次洗涤也不脱落；③不影响所固定抗体（抗原）的免疫反应性；④抗体的Fc段（或抗原）被固定在载体上时其与抗原（抗体）的结合空间位点应朝向反应液。常用的材料有：

1．塑料如由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的微孔反应板（48孔、96孔）或小珠、小试管等产品，是目前应用最广、最普及的一种固相载体，主要通过非共价键吸附抗原或抗体。该类载体的应用可以简化整个EIA的操作步骤，使之易于实现自动化。

2、可磁化颗粒或琼脂糖珠这类固相载体通过共价键结合抗原或抗体，在检测中可分散到整个反应混合液中，有很大的表面积，结合容量较大，因此结合较为有效，使免疫反应得以迅速进行；但制备固相抗体有较严格的技术要求。（二）包被蛋白经过纯化后，大部分抗原、抗体都可作为ELA反应的包被蛋白。抗原或抗体的浓度高，吸附在载体表面的也越多。（三）待测样品

EIA中的待测样品可以为细胞、血清、脑脊液、胸腹水及其他体液中的任何抗原、抗体，某些反应，如间接法检测丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）、竞争抑制法检测乙型病毒性肝炎核心区外型抗体（抗-HBcIgG）等需要对待测样品进行稀释后再进行分析.（四】酶标记物酶标记物是指将酶通过某些化学物（交联剂）和抗原、抗体、Fab片段等蛋白结合在一起的复合物，利用该复合物可以检测相对应的免疫反应原性蛋白。目前常用的交联剂有：戊二醛、氟二硝基苯、过碘酸钠等。（五）各种缓冲液如：包被液、封闭液、稀释液、洗液、显色底物和缓冲液、终止液等。三、酶免疫分析技术（－）均相EIA均相EIA技术的测定对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定。当酶与半抗原联结形成的酶标记物与相应的抗体反应后，由于抗体分子的空间阻碍效应或因酶的构型发生变化而激发或妨碍了它与底物的作用。因此，发生免疫结合反应后的酶呈激活或抑制状态，增强或不能催化底物的呈色反应；当加入样品后，样品中的半抗原竞争性地结合可与酶标记物反应的抗体，此时酶标记物就不再结合抗体分子，从而使酶标记物解除了激活或抑制状态，重新变为初始状态，因此，在此实验中无需分离即可直接测定发生特异性免疫反应的（二）异相EIA

1．竞争性EIA检测方法

1）酶标记抗原的竞争性EIA

在这种EIA中，将含特异性抗体的免疫球蛋白包被在固相载体上，然后以不同比例加人含待测抗原和酶标记抗原的溶液，过量的酶标记抗原和非标记抗原与限量的、包被在固相载体上的抗体一起温育，由于油结合位点数比总的抗原结合位点数少，因此，Ag－E与Ag互相竞争与固相抗体结合。洗去游离的Ag－E和Ag后，测定固相抗体结合的Ag－E酶的活性，即可对被测Ag进行定量。其示意图如图1所示。

图1竞争法测抗原2．非争性EIA检测方法

1）直接法这与免疫荧光技术的直接法相似，将所选择的酶标记抗体与相应的抗原共同孵育，然后用该酶的特殊底物进行显色，揭示抗原一抗体复合物的存在。2）双抗体夹心法①将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。然后洗涤除去未结合的抗体及杂质。③加受检标本使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。然后洗涤除去其他未结合的物质。③加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。然后彻底洗涤未结合的酶标抗体。。此时，固相载体上带有的酶量就代表标本中受检抗原的量。④加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物变为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。‘图2双抗体夹心法测抗原测量原理光密度检测利用了Labsystems传统垂直光密度检测的概念，即光束经过整个标本的垂直测光法。在垂直测光法中，光的吸收与板孔中吸光物质的多少成比例。吸光值由以下公式表示：A=(a/s)×mA=(a/s)×m式中，