生物基因工程的基本操作程序课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

基因工程的基本操作程序第三章第二节本节聚焦基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？01基因工程操作的每一步设计的技术和方法有哪些？02从社会中来1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。转基因抗虫棉抗虫的机制是什么？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?从社会中来Bt抗虫蛋白Bt基因取出？转移？从社会中来

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉

（有抗虫特性）导入Bt基因重组DNA分子目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定与载体拼接第一步：目的基因的筛选与获取筛选合适的目的基因目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因。第一步：目的基因的筛选与获取筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因明确Bt基因的序列信息，对Bt抗虫蛋白有深入了解利用序列数据库（如GenBank）、序列对比工具（如BLAST）等，找到合适的目的基因第一步：目的基因的筛选与获取筛选合适的目的基因获取目的基因的方法人工合成目的基因通过构建基因文库来获取目的基因基因比较小、核苷酸序列已知的序列，通过DNA合成仪用化学方法直接合成。第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因PCR-聚合酶链式反应：根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因核苷酸序列进行大量复制的技术。第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因各种组分耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液四种脱氧核苷酸(dNTP)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸一般添加Mg2+（激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶）第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？ATP结构中的五碳糖为核糖，而dATP结构中的五碳糖为脱氧核糖。ATP转移掉两个磷酸基团后剩下的结构就是腺嘌呤核糖核苷酸，第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因PCR反应过程3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链。B.复性温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。C.延伸温度上升到72℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因PCR反应过程第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮循环的产物第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因PCR结果：PCR产物检测：由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式扩增约为

，其中n为扩增循环的次数。指数2n变性90℃以上延伸72℃左右复性50℃左右常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因下图是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，都不合理，请分别说明理由。第1组：引物Ⅰ和Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。如果循环n次，则共需消耗多少对引物？共需消耗2n－1对引物。第一步：目的基因的筛选与获取利用PCR获取和扩增目的基因利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’第3轮；1/4。PCR中的数量关系复制次数123nDNA分子数含引物的DNA分子数含其中一种引物的DNA分子数同时含两种引物的DNA分子数共消耗引物的对数含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数2482n2482n1＝21－13＝22－17＝23－12n－10＝21－22＝22－26＝23－22n－21＝21－13＝22－17＝23－12n－10＝21－20＝22－42＝23－62n－2nPCR扩增技术和体内DNA复制的异同项目体内DNA复制PCR扩增技术解旋方式场所酶温度条件结果相同点解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋细胞内(主要在细胞核内)PCR扩增仪内解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行DNA分子DNA片段或目的基因模板：均需要DNA的两条单链作为模板；原料：均为4种脱氧核苷酸；酶：均需DNA聚合酶第二步：基因表达载体的构建获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？不能。游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解。即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；使目的基因能在受体细胞中表达和发挥作用。终止转录起始转录第二步：基因表达载体的构建启动子：一段有特殊序列的DNA片段。位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。类别：诱导型启动子组成型启动子组织特异性启动子诱导物作用诱导型启动子激活或抑制目的基因表达如：光诱导、热诱导、创伤诱导、真菌诱导、共生细菌诱导表达基因启动子等。终止子：一段有特殊序列的DNA片段。位于基因的下游，相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来。第二步：基因表达载体的构建基因表达载体构建过程：载体（质粒）DNA分子（含目的基因）限制酶处理带有黏性末端或平末端的切口有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种第二步：基因表达载体的构建启动子终止子构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？应该插入启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能，因为SmaⅠ并不位于启动子终止子之间，基因无法表达，并且切割会破坏质粒的抗生素抗性基因，影响进一步的筛选。第二步：基因表达载体的构建启动子终止子基于质粒和外源DNA的情况，可以如何选择限制酶进行酶切？与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？只使用EcoRⅠ处理质粒和外源DNA，或者同时使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶。可以防止质粒、目的基因的自身环化连接；还可以防止目的基因与载体的反向连接。第二步：基因表达载体的构建使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？载体目的基因自连片段间连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1第二步：基因表达载体的构建限制酶的选择原则图甲可选择PstⅠ，不选择SamⅠ。图乙中不选择SmaⅠ。不破坏目的基因保留标记基因、启动子、终止子、复制原点通常选择相同的限制酶切割质粒和目的基因，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，为了保证目的基因和质粒定向连接，可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶同时切割目的基因和质粒。确保出现相同黏性末端第三步：将目的基因导入受体细胞目的基因(基因表达载体)导入受体细胞的方法导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法（常用）花粉管通道法（我国科学家独创）显微注射法Ca2+处理法第三步：将目的基因导入受体细胞导入植物细胞：花粉管通道法（我国科学家独创的将Bt基因导入棉花细胞的方法）在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；操作方式：第三步：将目的基因导入受体细胞导入植物细胞：农杆菌转化法转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌：一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。(随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。)第三步：将目的基因导入受体细胞导入植物细胞：农杆菌转化法第三步：将目的基因导入受体细胞导入植物细胞：农杆菌转化法转化原理：农杆菌细胞内含有

，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的________可转移至被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的

。T-DNA染色体DNA上Ti质粒第三步：将目的基因导入受体细胞导入植物细胞：农杆菌转化法转化过程：构建导入目的基因插入植物细胞染色体DNA上表达新性状转入农杆菌Ti质粒目的基因表达载体植物细胞第一次拼接第二次拼接第一次导入第二次导入第三步：将目的基因导入受体细胞导入植物细胞：农杆菌转化法操作方式：方法一：可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。第三步：将目的基因导入受体细胞导入微生物细胞：Ca2+处理法转化原理：Ca2+

处理大肠杆菌细胞，可使细胞处于一种

的生理状态。能吸收周围环境中DNA分子转化过程：Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子真核生物蛋白质编码基因导入原核细胞，能产生目标蛋白质吗？要如何处理？不能，应取目标蛋白质的mRNA逆转录为cDNA后，构建表达载体并导入原核细胞内才能正确表达蛋白质。第三步：将目的基因导入受体细胞导入动物细胞：显微注射法目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵发育具有新性状的动物操作过程：为什么选择受精卵细胞作为受体细胞？受精卵个体大，易操作；受精卵全能性高，易培养成完整个体。第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因插入位点为得到能产生人胰岛素的大肠杆菌，现设计获得基因表达载体如图。如何获得能在大肠杆菌内正常表达的人胰岛素基因。从人体胰岛B细胞获得胰岛素mRNA，逆转录得到cDNA，RCR扩增得到大量目的基因。使用什么样的限制酶处理目的基因和质粒，能得到更多能正确连接的表达载体。使用MunI和SalI两种限制酶同时处理目的基因和质粒，再用连接酶连接。第四步：目的基因的检测与鉴定设计一个合适的选择培养基，筛选得到成功转入了基因表达载体的大肠杆菌细胞。目的基因插入位点已知，β半乳糖苷酶可分解无色的X-gal并产生蓝色的产物，使菌落呈现蓝色，反之呈白色。将受体细胞与基因表达载体混合培养一段时间后，置于添加了氨苄青霉素和X-gal的培养基上培养，待长出菌落后选择白色的菌落，作为工程菌生产人胰岛素。第四步：目的基因的检测与鉴定导入重组质粒导入原质粒导入目的基因未导入成功白色活菌蓝色活菌死亡死亡载体表型选择第四步：目的基因的检测与鉴定分子水平检测个体水平检测抗原-抗体杂交技术抗虫或抗病接种实验目的基因是否导入（DNA）目的基因是否转录（mRNA）目的基因是否翻译（蛋白质）性状是否体现PCR等技术标记基因可以辅助对受体细胞进行了筛选，为什么基因工程的第四步还要对目的基因进行检测和鉴定？对于细菌而言，含抗生素的选择培养基上能生长的细菌可能导入了基因表达载体，也可能是导入了未插入目的基因的空载体。即便导入了基因表达载体，但是不清楚目的基因插入位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。目的基因检测鉴定方法第四步：目的基因的检测与鉴定分子水平检测：目的基因是否导入转基因棉花提取DNAPCR如：检测棉花染色体DNA上是否存在Bt基因琼脂糖凝胶电泳分子水平检测：目的基因是否转录如：检测棉花Bt基因是否翻译出mRNA转基因棉花提取mRNA逆转录cDNA琼脂糖凝胶电泳对应引物PCR扩增第四步：目的基因的检测与鉴定分子水平检测：目的基因是否导入如：检测棉花染色体DNA上是否存在Bt基因分子水平检测：目的基因是否转录如：检测棉花Bt基因是否翻译出mRNA转基因棉花目的基因DNA（单链）探针DNA-DNA杂交带/DNA-RNA杂交带碱基互补配对第四步：目的基因的检测与鉴定注射小鼠体内第四步：目的基因的检测与鉴定分子水平检测：目的基因是否翻译如：检测棉花检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白抗体标记抗体抗原抗体杂交提取蛋白电泳分离脱分化抗原抗体特异性结合第四步：目的基因的检测与鉴定个体水平检测：性状是否体现转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常基因工程的基本操作程序目的基因的筛选和获取-前提利用PCR获取和扩增人工合成构建基因表达载体-核心目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞-关键农杆菌转化法(植物)显微注射法(动物)感受态细胞转化法(微生物);目的基因的检测与鉴定-保证分子检测：是否插入、转录、翻译个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。到社会中去面临棉铃虫的危害，有抗虫棉是否一劳永逸、高枕无忧？如何减缓棉铃虫抗性产生？并不是，在抗虫棉持续的筛选环境下，一旦出现了有抗性的棉铃虫个体，其抗性会快速在种群中扩展开，抗虫棉失去实际的抗虫特性。基因策略：分子水平提高抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。如转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达结构、提高杀虫基因表达量等。田间策略：种植过程设计专用的庇护所，即为少部分害虫提供正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫群体。宏观调控策略：分区种植，加强抗性监测，进行严格的安全性评价等。探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验原理：利用PCR在体外进行DNA片段扩增①

PCR利用了DNA的________原理，通过___________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够_______________的仪器，一次PCR一般要经历_____次循环；②

PCR扩增DNA片段还利用了______________的原理；热变性调节温度自动调控温度30DNA半保留复制探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验原理：DNA片段电泳鉴定①

DNA分子具有______________，在一定的_____下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在______的作用下，这些__________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_______；可解离的基团pH电场带电分子电泳与它所带电荷相反碱性条件下带负电荷从电泳槽负极向正极移动探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验原理：DNA片段电泳鉴定②

凝胶中DNA分子迁移速率与___________、_______________和_____等有关③

凝胶中的DNA分子通过______，可以在波长为_________的________下被检测出来。凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象大分子小分子探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验目的：材料用具：①

了解PCR和电泳鉴定的基本原理。②

尝试进行PCR的基本操作，并用电泳鉴定PCR的产物。仪器用具：PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）材料：4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验步骤：利用PCR在体外进行DNA片段扩增移液离心反应微量移液器PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书微量离心管离心10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）设置PCR仪循环程序放入微量离心管反应探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验步骤：DNA片段电泳鉴定配制琼脂糖溶液根据待分离DNA片段的大小,使用电泳缓冲液配制质量体积比0.8%～1.2%琼脂糖溶液沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化稍冷却加入核酸染料探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验步骤：DNA片段电泳鉴定制备凝胶温热的琼脂糖溶液倒入模具插入梳子形成加样孔凝胶溶液完全凝固拔出梳子取出凝胶放入电泳槽内电泳缓冲液加入电泳槽没过凝胶1mm探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验步骤：DNA片段电泳鉴定加样混合PCR产物与凝胶载样缓冲液（含指示剂）微量移液器混合液注入凝胶加样孔内一个加样孔加入标准参照物(分子大小)据阴阳极距离设定1～5V/cm电压指示剂前沿近凝胶边缘停止电泳电泳探究·实践DNA片段的扩增和电泳鉴定实验步骤：DNA片段电泳鉴