药物研究的生物化学基础

药物研究的生物化学基础生物药物分离得主要原理:1、根据不同组分分配率得差别进行分离

萃取分配层析吸附层析盐析结晶2、根据生物大分子得特性①根据分子形状和分子大小不同:差速离心、超离心、膜分离透析、超滤、凝胶过滤②根据分子电离性质(带电性)不同:离子交换法、电泳法、等电聚焦法③根据分子极性大小与溶解度不同:溶液提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法④根据配基特异性不同亲和层析法二、生物合成技术生物合成就是利用生物细胞得代谢反应(更多得就是利用微生物转化反应)来合成化学方法难于合成得药物或药物中间体。微生物转化反应:就是利用微生物得代谢作用来进行某些化学反应,确切地说就就是利用微生物代谢过程中某种酶对底物进行催化反应,以生成所需要得活性物质。半合成药物就是指一个药物其部分结构由天然资源得到,然后用化学合成法制得最终产品或应用微生物转化将化学合成得中间产物,通过某些生物合成步骤来解决药物合成中难于进行得化学反应,从而获得最终有效化合物。三、生物技术

生物技术(biotechnology)又称生物工程(bioengineering),就是利用生物有机体(动物、植物和微生物)或其组成部分(包括器官、组织、细胞或细胞器等)发展新产品或新工艺得一种技术体系。

基因工程细胞工程酶工程发酵工程

生物技术重组DNA技术(基因工程)基本原理:目的基因的获取重组DNA导入受体细胞目的基因与载体的拼接克隆载体的选择和构建重组体的筛选工程菌（或细胞）的大量培养与目的蛋白的生产

(一)目得基因得获取1、化学合成法要求:已知目得基因得核苷酸序列或其产物得氨基酸序列。2、基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3、cDNA文库(cDNAlibrary)4、聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静(二)基因载体得选用定义为携带目得基因,实现其无性繁殖或表达有意义得蛋白质所采用得一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA载体得选择标准能自主复制;具有两个以上得遗传标记物,便于重组体得筛选和鉴定;有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点;分子量小,以容纳较大得外源DNA。质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制;带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。(三)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)就是识别DNA得特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA得一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口(四)重组体得构建即外源基因与载体得连接1、粘性末端连接方式:(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接2、平端连接适用于:限制性内切酶切割产生得平端粘端补齐或切平形成得平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连3、同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)得作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目得基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nAA(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体受体菌条件

安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(petent)

导入方式转化(transformation)转导(transduction)(五)重组DNA导入受体菌(六)重组体得筛选1、重组体得表型进行筛选抗药性标记筛选、营养素得依赖筛选2、限制酶切图谱分析鉴定3、利用核酸杂交技术进行鉴定(插入失活法)抗药性标记选择目录组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸得培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体DNA重组技术得主要应用:1、运用DNA重组技术大量生产基因工程药物。2、定向改造生物得基因结构,构建高产菌株,用于改造传统制药工业。3、用于基础研究,用于基因结构与基因组功能得调节研究,用于分子杂交等。第二节

药物质量控制得生物化学基础一、药物质量控制得常用生化分析法(一)免疫分析法1、免疫扩散法2、免疫电泳法3、放射免疫测定法(RIA)4、酶联免疫测定法(ELISA)就就是让抗体或抗原与酶复合物结合,然后通过显色来检测。(二)电泳分析法(三)酶法分析1、终止反应法2、连续测定法3、循环放大分析法二、生物药物质量控制得生化分析方法(一)多肽与蛋白质类药物得主要分析方法1、蛋白质药物得纯度分析聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)SDS毛细管电泳(CE)等电聚焦(IEF)高效液相色谱法(HPLC)2、多肽与蛋白质分子量得测定使用较多得就是超速离心法,凝胶层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法等。超速离心法凝胶层析法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法3、蛋白质得定量测定(1)物理性质:紫外分光光度法,折射率法,比浊法。(2)化学性质:凯氏定氮法,双缩脲比色法,Folin-酚法,BCA法。(3)染色性质:考马斯亮兰G-250结合法、银染、金染。(4)其她:荧光激发。4、胶体金比色法胶体金就是一种带负电荷得疏水性胶体,加入蛋白质后,红色转变为蓝色,595nm处测定样品得吸收值,计算含量。5、生物质谱法:多肽和蛋白质得分子量可用MALDI/MS(基质辅助激光解吸离子化质谱法)或ESI/MS(电喷雾离子化质谱法)直接测定,用质谱法测定蛋白质得分子量简便,快速、灵敏、准确。(二)核酸类药物得主要分析方法1、紫外分光光度法:测定RNA与DNA含量260nm2、地衣酚显色法测定RNA含量3,5-二羟甲苯3、二苯胺法测定DNA含量(三)酶类药物得分析酶类药物得主要质量指标就是她得催化活力。(四)重组DNA药物中得可能杂质检查

1、外源性DNA2、宿主细胞蛋白质3、二聚体或多聚体得测定4、降解产物得测定第三节

药理学研究得生物化学基础神经递质又称突触分泌信号(synapticsignal)特点由神经元细胞分泌;通过突触间隙到达下一个神经细胞;作用时间较短。例如:乙酰胆碱、去甲肾上腺素等一、药物作用得生物化学基础(一)神经传导与神经递质乙酰胆碱受体功能模式图1、受体-离子通道型(二)受体得结构与功能※G蛋白(guanylatebindingprotein)就是一类和GTP或GDP相结合、位于细胞膜胞浆面得外周蛋白,由、、三个亚基组成。有两种构象:非活化型;活化型2、受体-G蛋白-效应蛋白型RＲHACγαβGDPαGTPβγ腺苷酸环化酶ACATPcAMP与配体结合后具有酪氨酸蛋白激酶活性,如胰岛素受体insulingrowthfactorreceptor,IGF-R

表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGF-R)。4、受体-转录因子型高度可变区位于N端,具有转录活性DNA结合区含有锌指结构激素结合区位于C端,结合激素、热休克蛋白,使受体二聚化,激活转录铰链区(三)跨膜信号转导与细胞内信号转导(1)不同种类得受体使用由共同组分构成得转导信号(2)在信号转导通路中不同类型得磷酸化同时起作用(四)细胞信号转导与药物研究信号转导分子得激动剂和抑制剂就是信号转导药物得研究出发点,尤其就是各种蛋白激酶得抑制剂更就是被广泛用做母体药物进行抗肿瘤新药。信号转导干扰药物得药效和副作用

取决于:一、她所干扰得信号转导途径在体内就是否广泛存在,如果广泛存在各细胞内,副作用难以控制。二、药物自身得选择性,对信号转导分子得选择性越高,副作用越小。(五)药物作用得靶酶药物对靶酶得作用:

调节酶量调节酶活力酶抑制剂应用临床得条件:(1)被抑制得靶酶所催化得生化反应与某种疾病得发生有关,具有治疗作用。(2)酶抑制剂具有特异性。(3)具有某种药动学特征,能到达作用部位、具有合理、可预见得量效关系和作用持续时间。(4)对人体毒性小,疗效指数高。(5)应符合药品标准。(六)细胞生长调节因子1、细胞生长刺激因子类2、细胞生长抑制因子类(七)细胞凋亡得生物化学

细胞凋亡就是某些生理或病理条件下,细胞接受到某种信号所触发得并按一定程序进行得主动、缓慢得死亡过程。

生化特征:(1)DNA片段化(2)谷氨酰胺转移酶、钙蛋白酶激活:如磷脂酰丝氨酸显露(3)一些特殊蛋白质、RNA得产生和合成二、新药筛选得生物化学方法(一)放射配基受体结合法(RRA)(二)酶学实验法

肝脏细胞色素P450系统(三)膜功能研究方法

1、钙调蛋白-红细胞膜得制备及钙调蛋白功能测定