食品毒理学 课件 第八章外源化学的特殊毒性

第八章外源化学物的特殊毒性生殖是使种族延续的各种生理过程的总称。生殖过程一般是指从配子形成直到胎儿娩出的整个过程，因此具有广泛的含义，其中包括精子的发生、卵的形成、配子的释放、受精、卵裂和胚泡发育、着床、胚胎发生、胎儿发育、分娩。而胎儿的娩出也并不意味着胎儿发育成熟的终止，从广义上说还应包括胎儿娩出后的新生儿期、哺乳期、直到性成熟的整个过程。

化学品对生殖发育的损害不仅与妊娠母体有关，带有致畸因子的雄性也会使胎仔发生畸形。例如给雄鼠经口染毒反应停，使之与未染毒的雌鼠交配，引起严重的胎仔畸形。接触二硫化碳男工的配偶发生流产，早产或分娩畸胎儿增多。对生殖发育有害的化学品不仅能作用于妊娠器官形成期，造成形态畸形，对妊娠前期的影响还可发生不育，对胎期的毒效应，可在出生后观察到发育、行为、代谢功能的障碍或子代肿瘤发生率增高。所以综合考虑有害环境因素对母体和父体的影响，将形态致畸与行为致畸结合起来进行观察，将生殖毒性和发育毒性结合起来进行研究已是发展的趋势。第一节生殖发育毒性及评价方法一、基本概念1、生殖毒性：

指对雄性和雌性生殖功能或能力的损害和对后代的有害影响。生殖毒性既可发生于妊娠期，也可发生于妊前期和哺乳期。表现为外源化学物对生殖过程的影响，例如生殖器官及内分泌系统的变化，对性周期和性行为的影响，以及对生育力和妊娠结局的影响等。2、发育毒性

指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用。具体表现可分为:

发育生物体死亡：指受精卵未发育即死亡，或胚泡未着床即死亡，或着床后生长发育到一定阶段死亡。早期死亡被吸收或自子宫排出(即自然流产)，晚期死亡成为死胎。生长改变：即生长迟缓。能引起胚胎死亡和畸形的毒物多数能引起生长迟缓。一般认为胎儿的生长发育指标比正常对照的均值低2个标准差时，即可定为生长迟缓。胎鼠胸骨及枕骨骨化迟缓及低出生体重等是生长迟缓的较敏感指标。生长迟缓造成的局部发育不全可视为畸形，如脑小畸形和眼小畸形等。功能缺陷：包括器官系统、生化、免疫等功能的变化。功能缺陷往往要在出生后经过相当时间才能诊断。如听力或视力异常、行为发育迟缓等。结构异常：指胎儿形态结构异常，即畸形。致畸性是指化学物在胚胎发育期间引起永久的结构与功能异常的性质。致畸物是指出生前接触，诱发永久的结构与功能异常的物质。3、畸形、畸胎和致畸物畸形:器官形态的异常。

畸胎:具有畸形的胚胎或胎仔。

致畸物或致畸原:凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。

致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。

胚胎毒性作用

外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。母体毒性作用

母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。

母体毒性作用与致畸作用关系具有致畸作用，但无母体毒性出现。出现致畸作用的同时也表现母体毒性。不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。

畸形与变异在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。

二、致畸作用的毒理学特点器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感剂量与效应关系较为复杂剂量效应关系复杂的表现及原因致畸作用的剂量反应曲线较为陡峭致畸作用最大无作用剂量问题尚有不同意见

物种差异以及个体差异在致畸作用中较为明显在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。

三、致畸作用机理

Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，包括突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变核酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。

干扰基因表达基因突变与染色体畸变损伤细胞和分子水平的翻译细胞调亡干扰细胞通过胎盘毒性引起发育毒性干扰母体稳态内分泌干扰作用

四、生殖与发育毒性的特点及靶器官生殖与发育过程包括配子(精子与卵子)的发育与形成、交配、受精、合子形成与植入、胚胎形成与发育、分娩等阶段。生殖与发育过程的每个阶段所涉及的细胞或器官都可能成为外源化学物毒作用的靶。1.亲性腺作用(性腺毒性)某些化学物可作用于性腺，影响生殖器官的发育与性腺成熟，或造成性腺组织病理学改变。某些化学物可影响配子的发生、增殖和成熟，使生殖细胞数量减少，功能减退及突变。。生殖细胞突变造成的畸胎与妊娠期内接触毒物的致畸作用不同，前者突变发生于父体或母体的性细胞中，突变诱发的畸形可传给后代。后者突变发生在胚胎的体细胞中，引起的畸形不具有遗传性。已知的亲性腺毒物有多种，包括固醇类药物，化疗药物，有机磷和有机氯农药，镉、铅、汞和二硫化碳等。外源化学物对生殖与发育过程的损害主要有以下几个方面：

2.亲胚体作用(胚体毒性embryotoxicity)某些化学物可作用于妊娠早期(即从受孕到胚体形成阶段)，对胚体发育产生损害作用。某些化学物可以降低胚体对必需营养素的利用度，如EDTA降低胚体对微量元素的利用度，氨基蝶呤降低胚体对叶酸的利用度。当给予母体这些化学物时，可导致与缺乏这些必需营养素相似的胚体毒性。胚体毒性、胎体毒性(fetotoxicity)和胚胎毒性(embryo-fetaltoxicity)是指由出生前接触引起对孕体的任何有害影响，包括结构和功能异常，或这种影响在出生后的表现。这些术语与有害作用诱发的瞬间／时期有关，而不考虑检测的时间。

3.亲胎盘作用(胎盘毒性placentaltoxicity)某些化学物可对胎盘造成损伤，改变胎盘血流量，降低胎盘对营养物质的转运，特异地干扰胎盘功能(如内分泌和代谢功能)。例如5-羟色胺使小鼠动、静脉狭窄，胎盘血流量减少，胎盘转运功能障碍，引起死胎和先天畸形；甲基汞改变人胎盘滋养层微绒毛对不能代谢的氨基酸的摄取，而致功能致畸，即先天水俣病。患儿严重神经迟钝，共济失调，步行困难，语言、咀嚼，下咽困难和大发作性癫痫。除上述外，化学物还可引起胎期毒性，哺乳期毒性(通过乳汁致婴儿中毒，如铅中毒)，和通过对中枢神经系统及全身机能状态的毒作用来影响生殖过程。某些化学物还能经胎盘致癌即致癌物由母血经胎盘进入胚胎，造成胚胎期接触，引发后代肿瘤。

化学物的生殖发育毒性有两个显著的特点：一是生殖过程较机体的其他系统或功能对某些化学物的毒作用更为敏感，在成体系统毒性的未观察到有害作用的水平(NOAEL)胎儿即可受到影响。例如妊娠期接触过不足以引起肿瘤的低剂量二乙基亚硝胺，仔鼠成年后再次接触，则肿瘤发生率增加。二是损害作用不仅表现在接触化学物质的机体本身，还可影响其后代。例如母鼠接触高浓度二硫化碳引起致畸作用，其子一代既使不再接触二硫化碳，交配后所生的子二代仔鼠也出现与子一代仔鼠几乎完全相同的畸变类型。环境流行病学控制的临床研究动物生殖与发育毒性试验体外筛选试验01030204生殖与发育毒性试验的目的和实验设计

生殖与发育毒性研究的目的是揭示化学品／药品对哺乳动物生殖发育的任何有害影响将研究的结果与所有可以得到的其他药理学和毒理学资料联系起来，以推测对人可能造成的生殖危险研究应包括成年动物和从受孕到子代性成熟的各个发育阶段接触受试物为检测接触所致的即发和迟发效应，应连续通过一个完整的生命周期，即从亲代受孕到子一代受孕B阶段受孕到着床：检查成年雌性生殖功能，胚胎着床前发育、着床。D阶段硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长，器官的发育与生长。E阶段出生到断乳：检查成年雌性生殖功能，新生仔对宫外生活的适应，断乳前的发育与生长。ClicktoaddTextF阶段断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长，对独立生活的适应，达到完全的性功能。C阶段着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能，胎体发育，主要器官形成。A阶段交配前到受孕：检查成年雄性和雌性生殖功能，配子的发育与成熟，交配行为，受精。一、实验设计1、动物选择

必须以哺乳动物为实验对象。一般要求使用与其他毒理学研究中相同的物种与品系，以免必须进行另外的预试验。原则上实验动物对受试物的动力学、毒效学及其他有关参数应与人最接近，如代谢过程与生物转化应与人相近、胎盘结构与人相似、健康、生育力强、多产、孕期短、自发畸形率低、价廉、易得和操作方便。首选啮齿类中的大鼠，因用大鼠获得的其他实验结果有可比性并积累了大量的背景资料。在胚体——胎体毒性研究中，传统上要求用第二种哺乳动物进行试验。家兔因其也有较广泛的背景资料和比大鼠更接近人的代谢类型而作为“非啮齿类”优选使用。但家兔孕期长短不定(32～36天)，有时缺乏毒性资料，对某些抗生素和消化道紊乱有易感性，在其他生殖毒性研究中较少用。1）剂量剂量选择应依据从所有已进行的药理学、急性和慢性毒性、以及动力学研究中得到的资料。高剂量应该在母体中产生轻度的毒性，如体重增长减少，体重增长速度改变(与扰乱了内环境稳定的机理有关)、特异的靶器官毒性、药理学反应增强(如镇静、惊厥)、阴道出血、流产等。在研究中，要对所观察到的效应进行剂量—反应关系分析时，推荐至少用三个剂量水平和适当的对照组。低剂量不应有任何可归因于受试物的有害作用。中剂量组应在高、低剂量之间按等比级差定位，应引起最小的毒作用。如果对结果有怀疑，应增加第四个剂量组，以免剂量间隔过大。实验结果应提供最高未观察到有害作用水平的剂量，否则应对该受试物进行进一步深入的研究。2、染毒原则高剂量进行的初步研究中，有明显的母体毒性的证据而未显示对胚胎的有害作用，也没有必要进行其他剂量水平的研究。最高限量剂量为1g(kg·d)假如仍未引起血浆和组织浓度增加时，可略微增加染毒剂量。测试低毒物质时，假如剂量达1g(kg·d)仍不产生胚胎毒性或致畸，则没有必要进行其他剂量水平的研究。2）接触途径与频率3）对照组应与人的接触途径相同，如果采用其他接触途径，必须依据动力学的资料。接触频率一般是一日一次，每日在相同时间染毒，并按体重调整染毒剂量。用与试验组相同的最大容量的赋形剂。当赋形剂可能有不良影响(如减少食物的摄取和利用)或影响受试物的作用时，应再设未处理对照组。二、三段试验方案

用一组试验研究全部生殖毒性的终点是不可能的，所以在决定适当的策略和选择研究设计时，应考虑该受试物和其类似物质所有可能得到的药理学、动力学和毒理学资料。对大多数医药产品来说，三段生殖毒性试验设计通常是适当的。关键因素是各个生殖阶段之间不得有间隔，即在三个有关联的阶段接触受试物的时期至少有一天的重迭，并能直接或间接地评价生殖过程的所有阶段。三段生殖毒性试验由生育力和早期胚胎发育毒性试验，胚体——胎体毒性试验(致畸试验)和出生前后发育毒性试验(围产期毒性试验)三部分组成(下图)。三段的划分是按有害作用诱发的时期，而不考虑检测的时间。Ⅰ生育力和早期胚胎发育毒性试验Ⅱ胚体——胎体毒性试验(致畸试验)Ⅲ出生前后发育毒性试验1、生育力和早期胚胎发育毒性试验1）研究目的评价化学物对配子成熟、交配行为、生育力、胚胎着床前和着床的影响(包括前述生殖发育过程A和B阶段的评价)。雌性对动情期、输卵管运输、着床和胚胎着床前阶段发育的影响。雄性检测对功能的影响(例如性欲、附睾的精子成熟等)。1、生育力和早期胚胎发育毒性试验2）动物至少一种，首选大鼠。每组性别、每组的动物数应足以对数据进行有意义的解释。建议每组性别各半、每组16~20只。1、生育力和早期胚胎发育毒性试验3）给药期应说明交配前染毒时间的长度并提供依据。一般采取雄性交配前四周开始重复染毒，直至交配成功。若要保证雌性受孕成功，雄性也可继续染毒，仍同笼至处死。雌性交配前两周开始染毒(可覆盖至少两个完整的动情期)直至着床。4）交配及受孕检查雄大鼠给药4周，雌大鼠给药2周后开始同笼。交配期2~3周，交配比例1∶1。实验程序应能识别出各窝的2个亲本，以避免不正确结果的分析和解释。1、生育力和早期胚胎发育毒性试验5）终末处死雌性一般在孕中期第13-15天终止妊娠。雄性在证实交配并受孕成功后处死检查。

1、生育力和早期胚胎发育毒性试验6）观察项目染毒期间观察雌、雄亲代体征和死亡(至少1次／日)，体重和体重改变(至少2次／周)，摄食量(1次／周)，镜检雌性阴道涂片(交配期间1次／天)和其他毒性研究中见到的靶效应。1、生育力和早期胚胎发育毒性试验7）结果评定综合对F0代观察的各项指标和参数，用合适的统计方法分析和评价。在分析对胎体(子一代)的影响时，应考虑下述参数：各组受影响的窝数比；每窝受影响的胎体的组平均百分率；受影响胎体总数比。

1、生育力和早期胚胎发育毒性试验2、胚体—胎体毒性试验(致畸试验)1）研究目的评价母体自胚泡着床到硬腭闭合期间接触受试物对妊娠雌性和对胚体—胎体发育的有害影响，即前述生殖发育过程中的C和D阶段，主要包括增强了与非妊娠雌性有关的毒性，胚体—胎体死亡、生长改变与结构异常。2、胚体—胎体毒性试验(致畸试验)2）动物通常用两种，一种是啮齿类，首选大鼠，另一种是非啮齿类，最好是兔。若仅用一种动物，需提出正当理由。每组动物数应足以对数据进行有意义的解释。建议每组16~20只。雌性宜用性成熟的，未交配过的动物。2、胚体—胎体毒性试验(致畸试验)3）给药期从着床期到硬腭闭合，即器官形成期，大、小鼠孕期的第6~15天，兔孕期的6~18天。4）终末处死与标本制作在分娩前一天处死怀孕母体，以防止自然分娩后，母体吞食畸形子。剖腹检查亲代受孕情况和胎体发育。除逐个检查所有胎体的存活和畸形外，尚需分别检查软组织和骨骼的异常。将每窝50％胎仔经茜素红染色后，做骨骼检查。另外50％胎仔经Bouin’s固定后，作内脏检查。当使用新鲜标本的显微解剖技术检查软组织改变时(对家兔胎体检查的最好方法)，100％的家兔胎体均作软组织和骨骼检查。2、胚体—胎体毒性试验(致畸试验)5）观察项目染毒期观察妊娠动物的体征和死亡(1次／日)，体重和体重改变(2次／周)，摄食量(1次／周)和在其他毒性研究中已证实的重要靶效应。有流产和早产征兆者处死并进行肉眼检查。处死时对所有妊娠动物进行尸体解剖和肉眼检查任何结构异常或病理改变。保存肉眼发现有改变的脏器，以便进行组织学评价，亦保存足够的对照组的相应脏器，以供比较。取出子宫，称带有胎体的子宫重，以得出妊娠雌性动物的净增重。计数黄体数，吸收胎数，活胎数与死胎数及着床点，称胎盘重并作肉眼评价，必要时可作组织学检查。称活胎体重，检查胎体性别，以及外观、内脏和骨骼畸形。2、胚体—胎体毒性试验(致畸试验)6）结果评定致畸研究的发现应根据观察到的效应和产生效应的剂量水平进行评价。有必要考虑所用试验动物的物种／品系的历史的致畸性资料。致畸研究进行适当，应提供一个符合要求的NOAEL(未观察到有害作用水平)的估计。虽然将实验结果外推到人的可靠性有限，然而NOAEL的建立，使得能以采取适当的安全系数。对母体的终点评价指标包括：体重、体重变化、食物消耗量和母体毒性体征及母体畸胎出现率等。对胎体影响的评价应包括：受影响的窝数比、每窝受影响胎体数的组间均数、受影响的胎体总数比、畸胎率和某单项畸胎率等。2、胚体—胎体毒性试验(致畸试验)7）影响致畸作用的因素致畸作用受多种因素影响，主要包括敏感期、遗传类型、剂量和母体毒性等。2、胚体—胎体毒性试验(致畸试验)8）母体毒性与致畸的关系母体毒性是指对怀孕母体的特异的(直接的作用)或非特异的(间接的作用)的有害影响。在致畸试验中，剂量选择应避免用诱发母体毒性的剂量，因为若怀孕母体中毒，而不能正常进食，由营养缺乏对胎儿产生的影响可能比化学物本身的影响还大。

9）致畸物及发育毒物的危险度评定由于致畸作用的机理尚未充分阐明，所以致畸物危险度评定方法也没有完全统一。已知的人类致畸物电离辐射：放射治疗，放射性碘，原子武器。感染：风疹，巨细胞病毒感染，单纯性疱疹，梅毒，弓形体病。代谢失调：克汀病，糖尿病，苯丙酮酸尿，男性化肿瘤，高温。药物和化学品：反应停，酒精，氨基蝶呤，雄性激素，麻醉剂，抗甲状腺药物，白消安，咖啡因，氯代联苯类，香豆素抗凝剂，环磷酰胺，二已基乙烯雌酚，敌螨普，三氟氯溴乙烷，异维A酸，锂，甲巯咪唑，有机汞化合物，有机溶剂类，苯妥因，腐霉利，四环素，三甲恶唑烷二酮，丙(基)戊酸。3、出生前和出生后发育毒性试验(围生期毒性试验)1）研究目的评价母体自着床至断乳期间接触化学物对妊娠／哺乳母体和对孕体及代发育直至成熟的有害影响(前述生殖过程的C-F阶段)。在此期间引起的毒性反应会延迟发生，故观察应继续到性成熟。有害影响主要包括增加与未妊娠雌性有关的毒性，子代出生前和出生后死亡，生长与发育的改变，子代中的功能缺陷(包括行为，青春期性成熟)和生殖(Fl代)。3、出生前和出生后发育毒性试验(围生期毒性试验)2）动物至少一种，首选大鼠。每性别、每组动物数应足以对数据进行有意义的解释。建议每组16-20窝。3、出生前和出生后发育毒性试验(围生期毒性试验)3）染毒期雌性从着床至哺乳期终止。3、出生前和出生后发育毒性试验(围生期毒性试验)4）实验程序及终末处死允许分娩和抚养子代到断乳。子代出生当天被定为出生后0天。在断乳时，每窝可选出部分雄性和雌性子代抚育到成熟并交配。有些实验室将亲代(F0)动物分组，分别或联合进行行为试验和生殖功能评价。5）观察项目染毒期间观察亲代体征和死亡(至少1次／日)、体重、体重增长(至少2次／周)和在以前毒性研究中见到的有评价价值的靶效应、妊娠的长度、分娩。6）结果评定综合亲代和子代各项指标观察的结果，对围产期给药的毒性及影响程度做出综合评价。发育毒物预筛试验一、体内预筛试验“生殖／发育毒性筛选试验”是1990年在伦敦的一次专家会上讨论和取得一致意见的，以后逐年完善，1995年正式在OECD化学品试验准则中确定下来。本法的依据是大多数出生前受到的损伤将在出生后表现为存活力下降和／或生长障碍。因此于仔鼠出生后，观察其外观畸形，胚胎致死，生长迟缓等发育毒性表现，而不进行传统常规试验中内脏和骨骼的检查，就可达到筛选的目的。本法所用动物少，检测终点少，实验周期短，但能提供有关化学物对生殖和／或发育可能发生影响的初步信息，是一种比较满意的发育毒物体内预测试验，并已有效地用于现有化学物的初筛。实验程序：动物用性成熟大鼠，每性别每组至少10只，以期提供8只孕鼠和足够的子代。一般至少用三个试验组和一个剂量组，剂量间隔2～4倍。至少在交配前2周，两性别同时开始染毒，雄鼠持续染毒4周(包括交配前、交配期、直至处死)。由于雄鼠在交配前染毒期限有限，且生育力观察可能不是睾丸毒性的特别敏感的指标，因此必须进行雄性生殖器官仔细的组织学检查，以了解对雄性生育力和对精子发生的影响。雌鼠在整个研究期间染毒，包括交配前期、受孕、孕期和到分娩后4天，．以交配期满14天计，共54天。经口染毒。交配通常为1∶1，雌、雄鼠固定搭配。雄鼠一般在染毒4周后处死，母鼠和仔鼠在分娩后4天处死，未孕雌鼠在最后一次交配后24～26天处死。生殖/发育毒性筛选试验图解观察项目：雌、雄亲代应于染毒第一天以后，每周一次和终末处死前称重，仔鼠在出生0天，出生后1天和4天称重。测定交配前至哺乳期间的食物消耗量，当受试物经饮水给予时，还应测定此期间的饮水量。在染毒期每天观察毒性体征，研究期间死亡或终末处死的成年动物，应肉眼检查、称重并保存卵巢、睾丸、附睾和其他附件以及所有显示肉眼可见损伤的器官，Bouin’s固定，作组织病理学检查。仔鼠出生后，记录窝重、仔鼠数、性别、活产、死产、小仔，观察外观显著异常，以及亲代和子代的任何行为异常。结果评定：根据观察到的毒性效应，尸检、肉眼和组织病理学发现，评价受试物的剂量与异常的发生和严重性之间的关系。包括大的损伤、证实靶器官、不育、畸形、对生殖和仔鼠行为的影响、体重改变和死亡率等。由于本试验的动物少，终点选择少和周期短，只能用作初筛。筛选结果即使是阴性的，也不表示对生殖／发育的绝对安全，虽然当实际接触剂量明显低于NOAEL剂量时，能提供可能安全的信息。而当结果是阳性的而又缺乏其它的生殖／发育毒性资料时，则有助于决定是否有必要进一步试验。二、体外预筛试验1.大鼠全胚培养(wholeembryoculture)取9.5日龄大鼠胚胎，剥去Reichert膜，在培养液中接触受试物，在孵箱中通气旋转培养48小时后，观察心脏搏动和卵黄囊循环、轴向正常旋转在背凸位、尿囊和绒毛膜融合、眼囊和耳囊、前肢芽和三个腮弓、前后神经管闭合及体节数目等胚胎发育情况，记录胚胎存活。二、体外预筛试验2.器官培养(organculture)利用胚胎肢芽，腭板、后肾、肺、肝、正常发育的牙齿和其他器官进行。以肢芽为例，取12日龄小鼠胚胎，在体视显微镜下选用52～55体节数的胚胎，取下前肢，置于含受试物的培养液中，连续通气浸没旋转培养3天，Bouin's固定，阿利新兰染色，制作肢体压片，检查肢体中软骨原基的发育与分化。3.胚胎细胞微团培养(micmmassculture)从11日龄大鼠胚胎取得原代中脑细胞微团(CNS)，肢芽区或其他区细胞微团，置于含有不同浓度受试物的培养瓶中，培养5天，用中性红判断细胞存活，用苏木精判断CNS分化数量，用阿利新兰判断肢芽软骨细胞的分化数量。外源化学物的致突变作用及评价方法基本概念化学毒物致突变的类型致突变作用机制和后果机体对致突变作用的影响观察化学毒物致突变作用的基本方法遗传：地球上的生物都能通过各种繁殖方式来保证其物种以相对稳定的生命形式和状态存在于自然界，这个过程是遗传。变异:

在物种的亲代之间或子代个体之间出现的不同程度的差异。基本概念突变(mutation)

基于染色体和基因的变异可遗传，称为突变。

自发突变(spontaneousmutation)

由于自然界中诱变剂的作用或由于偶然的复制、转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。诱发突变(inducedmutation)

人为造成或受某种化学、物理、生物等因素诱发产生的突变，简称诱变。

本章所用的遗传毒性和致突变性两个术语既有联系又有区别。致突变性和致癌性都是精确的概念，在一个实验群体中的突变率和癌发生率可以定量检测。遗传毒性是泛指对基因组的毒性，对基因组的毒作用可引起致突变性及其他各种不同的效应，如染色体畸变、噬菌体引起细菌死亡、DNA链断裂及细胞分裂抑制等。这些效应都可作为评价遗传毒性的终点。根据DNA改变牵涉范围的大小，在遗传毒理学中可将遗传损伤分为两类：基因突变染色体畸变基因突变

指在基因中DNA序列的改变。基因突变是分子水平的变化，在光学显微镜下无法看见，一般是以表型(如生长、生化、形态等)的改变为基础进行检测，也可通过核酸杂交技术、DNA单链构象多态分析及DNA测序等方法检测DNA序列的改变来确定。基因突变可分为以下几种基本的类型：碱基置换移码突变大片段损伤基因突变1．碱基置换指DNA序列上的某个碱基被其他碱基所取代。碱基置换又可分为转换和颠换两种。

转换：指嘌呤与嘌呤碱基、嘧啶与嘧啶碱基之间的置换(包括G：C→C：G)

颠换：指嘌吟与嘧啶碱基之间的置换(包括G：C→T：A，A：T→C：G)。基因突变基因突变转换和颠换发生后的后果取决于是否在蛋白质合成过程中引起编码氨基酸的错误。错义突变：如果碱基置换导致了编码氨基酸信息的改变，在基因产物中，一个氨基酸被其它的氨基酸所取代，称为错义突变。错义突变有可能使基因产物失活，也可能仅对基因产物的功能产生一定的影响或无影响，这取决于置换的氨基酸及其在蛋白质中的位置和作用。基因突变2．移码突变

指改变从mRNA到蛋白质翻译过程中遗传密码子读码顺序的突变，通常涉及在基因中增加或缺失一个或两个碱基对。DNA链碱基排列及密码的阅读是连续的，在基因中一处发生移码突变，会使其以后的三联密码子都发生改变，有时还会出现终止密码，所以，移码突变往往会使基因产物发生大的改变，引起明显的表型效应，常出现致死性突变。基因突变基因突变

3.大片段损伤密码子的插入或缺失，指在DNA链中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子，此时基因产物多肽链中会增加或减少一个或几个氨基酸，此部位之后的氨基酸序列无改变。染色体和染色质染色质：

真核细胞间期细胞核内伸展开的DNA蛋白质纤维。染色体：

真核细胞有丝分裂期高度螺旋化的DNA蛋白质纤维，是间期染色质进一步紧密盘绕折叠的结果。染色质和染色体是真核细胞内遗传物质DNA分子的存在形式；这种结构形式对遗传信息的稳定、传递和表达都有极为重要的影响。染色体畸变人体内每个细胞内有23对染色体。包括22对常染色体和一对性染色体.。性染色体包括：X染色体和Y染色体。含有一对X染色体的受精卵发育成女性，而具有一条X染色体和一条Y染色体者则发育成男性。染色体在形态结构或数量上的异常被称为染色体异常，由染色体异常引起的疾病为染色体病。现已发现的染色体病有100余种，染色体病在临床上常可造成流产、先天愚型、先天性多发性畸形、以及癌症等。染色体畸变染色体畸变人类X染色体(左)和Y染色体(右)指染色体的结构改变，染色体畸变牵涉的遗传物质改变的范围比较大，一般可通过在光学显微镜下观察细胞有丝分裂中期来检测。染色体结构改变的基础是DNA链的断裂，所以把能引起染色体畸变的外源化学物称为断裂剂。

染色单体型畸变组成染色体的两条染色单体中仅一条受损染色体型畸变两条染色单体均受损染色体畸变染色体畸变裂隙

断裂断片和缺失微小体

无着丝点环环状染色体双着丝点染色体倒位

易位插入和重复

辐射体1.裂隙：在一条染色单体或两条染色单体上出现无染色质的区域，但该区域的大小等于或小于染色单体的宽度。在制备染色体标本过程中，会因各种因素的影响形成裂隙，故认为裂隙并非染色质损伤，所以，在计算染色体畸变率时通常不考虑裂隙。2.断裂(break)同裂隙，但无染色质区域的大小大于染色单体的宽度。3.无着丝粒断片和缺失：染色体或染色单体断裂后，无着丝粒的部分可与有着丝粒的部分分开，形成断片，有着丝粒的部分称为缺失。发生在染色体或染色单体末端的缺失称为末端缺失，发生在臂内任何部分的缺失称为中间缺失。4.微小体(minutebody)中间缺失形成的断片有时很小，成圆点状，称为微小体。

染色体缺失及环状染色体的形成图

染色体插入和重复示意图

5.环状染色体(ringchromosome)染色体两条臂均发生断裂后，带有着丝粒部分的两端连接起来形成环状。通常伴有一对无着丝点的断片。

6.倒位(inversion)在一条染色体或染色单体上发生两处断裂，其中间节段旋转180℃后再重接。如果被颠倒的是有着丝点的节段，称为臂间倒位；如被颠倒的仅是长臂或短臂范围内的一节段，称为臂内倒位。

染色体的臂间倒位

染色体相互易位示意图

7.易位(tranlocation)当两条染色体同时发生断裂后，互相交换染色体片段。如果交换的片段大小相等，称为平衡易位(balancedtranslocation)。8.插入(insertion)和重复(duplication)一条染色体的断片插人到另一条染色体上称为插入。当插入片段使染色体具有两段完全相同的节段时，称为重复。染色体畸变一、DNA损伤与突变(一)碱基损伤1.碱基类似物的取代

2.烷化剂3.碱基的化学结构改变或破坏

4.嵌入DNA链突变机制突变的不良后果

体细胞突变生殖细胞突变癌变致畸衰老配子死亡死胎自发流产先天畸形一、机体修复DNA损伤的机制可分为两大类：1.损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤。

2.修复机制：DNA修复直接修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复光修复错配碱基修复碱基切除修复核苷酸切除修复机体对致突变作用的影响复制后修复呼救性修复关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入选的原则有：①选择的遗传毒性试验应包括5种类型的遗传学终点。②通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。③体内试验与体外试验配合。④应包括生殖细胞和体细胞。通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。观察化学毒物致突变作用的基本方法二、常用的致突变试验

(一)细菌回复突变试验(Ames试验)

鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突变株。(his-)正向突变回复突变代谢活化系统受试物观察化学毒物致突变作用的基本方法二、常用的致突变试验(二)微核试验

微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核试验(Micronucleustest，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。

观察化学毒物致突变作用的基本方法观察化学毒物致突变作用的基本方法(二)微核试验MNNCE观察化学毒物致突变作用的基本方法二、常用的致突变试验(三)染色体畸变分析

(四)姐妹染色单体交换试验（SCE）

观察化学毒物致突变作用的基本方法二、常用的致突变试验(五)果蝇伴性隐性致死试验(六)显性致死试验(七)程序外DNA台成试验

(八)转基因动物致突变试验(九)哺乳动物细胞基因突变试验观察化学毒物致突变作用的基本方法外源化学物致癌作用学习目的与要求掌握化学致癌的机制、化学致癌的过程；熟悉化学致癌物的分类；了解化学毒物致癌性判别的基本方法。重点：化学致癌的分子机制、化学致癌的过程。世界卫生组织癌症研究中心目前全世界发病率最高的癌症是肺癌，每年新增患者人数为120万。其次是乳腺癌，每年新增患者人数为100万。随后依次是肠癌94万，胃癌87万，肝癌56万，宫颈癌47万，食道癌41万。1775年——英国Pott

阴囊癌1895年——德国Rehn

职业性膀胱癌1915年——日本山极和市川试验性皮肤癌1922年——英国Kennway

动物皮肤癌1945年——英国Case职业性膀胱癌世界卫生组织癌症研究中心对于癌症预防的建议

减少脂肪摄入，使之低于30％总热量增加膳食纤维摄入量至每天20～30克，但不超过40克多吃新鲜蔬菜和水果避免肥胖控制饮酒少吃盐渍、盐腌和烟熏食物脂肪摄入过量的危害

乳腺癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胆囊癌发病率与脂肪摄入过多有关。研究表明，脂肪可增强小肠细菌作用，使求偶素活性增强，而求偶素是引起乳腺癌的重要因素之一。脂肪在通过肠道时可在细菌作用下形成二级产物，促进结肠癌变。脂肪过量分两个方面，一个是肉食，一个是炒菜的食用油，除了橄榄油对人体没有副作用外，其他油类都含有很高的饱和脂肪酸，而我们炒菜的油放得实在是太多了一点。蔬菜和水果摄入不足的危害

科学家对200项膳食与肿瘤关系的流行病调查结果进行总结，发现在156项研究中有128项显示摄入蔬菜和水果不足者易患下列常见癌，且危险性高两倍：肺癌、喉癌、口腔癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌。研究证明，蔬菜和水果中含有丰富的抗坏血酸、胡萝卜素、膳食纤维、叶酸，十字花科蔬菜亦含有较强的抑癌活性成分。抗坏血酸为氧化剂，可抑制活性氧自由基对细胞DNA的损伤，还能阻断致癌的亚硝胺类化合物在体内合成。膳食纤维不够导致疾病

膳食纤维是指不被体内吸收、利用的多糖类，包括纤维素、半纤维素和果胶。膳食纤维可通过增加粪便量刺激肠蠕动及稀释致癌物，减少致癌物对肠道的毒害。据报道，给52例切除结肠腺癌患者补充麦纤维4个月，可降低粪便中促癌物总胆汁酸含量的50％。重视叶酸

叶酸又叫维生素M、维生素B11。叶酸是B族维生素之一，因绿叶中含量十分丰富而得名。叶酸是参与DNA、RNA前体嘌呤和嘧啶以及蛋氨酸合成的重要成分，叶酸对多种癌症（肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌）有较好的抑制作用。其作用机理可能为：一是抗氧化作用，二是减少致癌物与DNA的形成。不良饮食习惯

食物在油煎炸时温度高达200℃以上，油脂进行着复杂的氧化、聚合、环化等反应。尤其经反复高温的剩油炸后可产生致癌物和促癌物。国外报道，多次使用的剩油加到饮料中可诱发大鼠肿瘤。这就是我们叫大家少吃油条、油炸臭豆腐的原因。烟熏食物熏肉在制作过程中产生致癌物——3．4苯并芘，并可渗透到食物去。饮酒国外报道，饮酒可增加妇女患乳腺癌的危险性，且随饮酒量增大而增高。霉菌已知有20多种霉菌及其毒素对动物有致癌性。我国食管癌和肝癌的高发可能与居民摄入霉菌污染的食物有关。强致癌食品的8大黑名单一、腌制食品：咸鱼产生的二甲基亚硝酸盐，在体内可以转化为致癌物质二甲基亚硝酸胺。咸蛋、咸菜等同样含有致癌物质，应尽量少吃。二、烧烤食物：烤牛肉、烤鸭、烤羊肉、烤鹅、烤乳猪、烤羊肉串等，因含有强致癌物不宜多吃。三、熏制食品：如熏肉、熏肝、熏鱼、熏蛋、熏豆腐干等含苯并芘致癌物，常食易患食道癌和胃癌。四、油炸食品：煎炸过焦后，产生致癌物质多环芳烃。咖啡烧焦后，苯并芘会增加20倍。油煎饼、臭豆腐、煎炸芋角、油条等，因多数是使用重复多次的油，高温下会产生致癌物。五、霉变物质：米、麦、豆、玉米、花生等食品易受潮霉变，被霉菌污染后会产生致癌毒素——黄曲霉菌素。六、隔夜熟白菜和酸菜：会产生亚硝酸盐，在体内会转化为亚硝酸胺致癌物质。七、槟榔：嚼食槟榔是引起口腔癌的一个因素。八、反复烧开的水：反复烧开的水含亚硝酸盐，进入人体后生成致癌的亚硝酸胺。环境致癌因素物理因素：辐射化学因素：化学致癌物生物因素：病毒一、化学致癌作用——多因素、多基因参与的多阶段过程致癌过程有多个与癌肿有关的基因参与不同器官来源、不同组织类型、临床阶段以至同一种肿瘤在不同地区所见的遗传变化是不同的多种环境致癌物、致癌因子或条件可协同作用个体的不同遗传背景对肿瘤的发生发展有重要影响二化学致癌过程1细胞癌变的多阶段学说从正常细胞基因突变或表达改变，发展到癌细胞，直至癌转移，是一个多阶段多基因调控多因素参与的过程。化学致癌过程三个阶段：引发阶段（initiation）促长阶段（promotion）进展阶段（progression）引发阶段——启动阶段，第一步骤

化学致癌物对靶细胞DNA产生损伤作用经细胞分裂增殖固定下成为突变细胞。化学致癌物不可逆的将正常细胞肿瘤细胞。起始步骤引发剂或启动剂相对迅速的过程促长阶段——第二阶段促进引发形成肿瘤细胞分裂生长。特点：⑴促癌物的作用长期、慢性⑵引发物和促癌物单独作用均不能引起肿瘤⑶引发必须发生在促长之前⑷引发作用是不可逆改变，促长在早期阶段的改变是可逆的具有促长作用的化学物质称为促长剂。进展阶段——第三阶段在肿瘤形成过程中，在促进之中或之后，细胞表现出不可逆的遗传学改变标志：遗传不稳定性增加和恶性变化，在形态上或功能代谢和行为方面逐渐表现出肿瘤的特征。一、用于致癌物筛选的短期试验（一）致突变试验：①基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验);②染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验;③原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导(细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)，SCE试验；④体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balb/c3T3细胞。一、用于致癌物筛选的短期试验：（二）哺乳动物短期致癌试验：哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验，指时间有限(数月)，靶器官有限。较受重视的短期致癌试验有下列四种：1．小鼠皮肤肿瘤诱发试验：于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯(TPA)。2．小鼠肺瘤诱发试验：染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸入，一般30周可结束实验，观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。此试验也可设计)b检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为乌拉坦，促长剂为二丁基经基甲苯(BHT)。3．大鼠肝转化灶诱发试验。对大鼠进行肝大部切除术后，给以受试物，一般可在8～14周结束实验，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有γ-谷氨酰转肽酶活性升高，G6P酶和ATP酶活性降低，以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)。4．雌性大鼠乳腺癌诱发试验，一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，实验周期为6个月。此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。一、用于致癌物筛选的短期试验：（二）哺乳动物短期致癌试验：何时应考虑进行致癌性评价：①人体可能长期暴露于该化学物；②该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似；③反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变。如在3种遗传毒理学短期试验均得到阳性结果，可预测为遗传毒性致癌物；如在3种遗传毒理学短期试验均得到阴性结果，可预测为非遗传毒性非致癌物；如经5种遗传毒理学短期试验仍不能预测其致癌性的化学品，应优先进行哺乳动物致癌试验。

①临床上连续应用6个月以上的药品；对慢性或复发性疾病需间断性长期反复治疗的药品；造成长期暴露的给药系统。②已知属于对人具有潜在致癌性的同类化合物；构效关系提示具有致癌危险性的物质3长期毒性试验发现癌前病变3原型或代谢产物在组织内长期蓄积，引起局部组织反应或其他病理生理反应的物质。③具有遗传毒性的物质往往具有致癌性，如拟长期使用，应进行慢性毒性试验(1年)，检测早期致癌反应。④拟用于病人预期寿命少于3年的药品不必进行致癌试验，如肿瘤治疗药等。

⑤局部使用吸收很差的药物不必进行经口致癌试验。

⑥已具有致癌性资料的药物的各种酸、碱、盐应提供其在药物动力学、药效学或安全性方面没有明显改变的证据，对于酯和复杂的衍生物在确定是否需要进行致癌试验时也应有类似的资料，并应个案讨论。

⑦基本作为替代治疗的内源性物质不需要进行致癌试验。但对生物技术制品，下列情况可考虑进行致癌试验：生物学作用明显不同于天然相应物质的制品；结构明显不同于天然相应物质的制品；在人体引起局部或全身浓度明显增加的制品。二、哺乳动物长期致癌试验：（一）试验动物

物种和品系：要求用两种实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。啮齿类动物对多数致癌物易感性较高，寿命相对较短，费用也较低，生理和病理学资料较完备，因此使用最广泛。在选择品系时应选择较敏感、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系。性别：为接近人类情况，应使用同等数量的雌雄两种性别的动物。年龄：使用刚断乳的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。（二）剂量选择和动物数量

致癌试验一般设三个试验组美国NCI推荐以最大耐受剂量(MTD)为高剂量。最大耐受剂量是由90天毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10％，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。ICH(1995)提出，高剂量选择可以根据：①毒性终点，即最大耐受剂量(MTD);②药代动力学终点，啮齿动物血浆AUC(时量曲线下面积)为人的25倍；③选择吸收饱和剂量;④药效学终点，不应产生生理学和内稳态紊乱;⑤最大可行剂量，受试物在饲料中最高含量为5％。限制剂量为1500mg／(kg体重·d)。（二）剂量选择和动物数量中及低剂量组则按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的1/2或1/3。低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但低剂量组应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10％。中剂量组介于高、低剂量之间，如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。同时应设阴性(溶剂或赋形剂)对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的化学结构相近。动物数量：每组至少有雌雄各50只动物，希望在出现第一个肿瘤时，每组还有不少于25只动物。

（三）染毒途径

经口染毒是将受试物给予实验动物的常用途径，一般把受试物掺人饲料或饮水中连续给予动物(5～7天/周)。若掺入后的适口性不良，可用灌胃法。掺入浓度要定期监测，观察其均匀性和稳定性，掺入的浓度一般不超过5％。经皮染毒，涂敷受试物的面积一般不少于动物体表总面积的10％。必须保证受试物与皮肤良好接触，并防止动物舔食。每天涂抹一次，每周3～7次。吸入染毒，每天染毒4小时，每周5～7天。染毒柜内受试物浓度应定期或连续监测，其分布应均匀、恒定。其他注射途径可根据需要采用。（四）试验期限(1)一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为18个月，大鼠为24个月；然而对于某些生