生物工程专业综合实验

生物工程专业综合实验

第一部分

操作性实验人参发根培养及皂苷含量分析

第一节发根的由来1.发根培养体系的建立

发根是由发根农杆菌Agrobacteriumrhizogenes,侵染植物创伤部位细胞，转化并整合发根农杆菌Ri质粒上的一段基因到植物细胞中，这段基因的表达导致细胞分化形成发根。严格来说是一种植物疾病。它是一个革兰氏阴性土壤细菌。

发根生长快，不依赖于激素，可被开发成生产植物次生代谢产物的有效资源。

此外，发根可以在一定条件下再生成对应的整株植物，而且发根的基因和代谢性状比较稳定。图1发根形成原理示意图图2人参发根发根诱导图第二节

实验流程、目的、原理及注意事项实验内容概要图3实验内容概要1.人参发根培养1.1实验的目的及意义（1）掌握植物组织（发根）的培养方法及生长数据的测定及曲线绘制方法。（2）了解植物组织（发根）的形成原理；（3）了解发根生长过程形态变化。1.2实验原理人参发根是发根农杆菌诱导人参创伤组织而形成的无性系、不依赖于激素、可无限增殖的根组织，在MS培养基上发根可以利用其大量和微量元素及碳源快速成长并合成皂苷。1.3具体流程1.3.1培养基配制灭菌

采用1/2MS成品培养基，按药品说明配制（2.47g1/2MS成品，30g蔗糖，定容到1000ml，充分溶解15-20min），用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8（用精密pH试纸或pH计），培养基分装到500ml三角瓶100ml/瓶；封口膜封口后，116摄氏度高压灭菌30min，冷却至室温备用。1.3.2接种

取1/2MS培养好的人参发根，手术刀于灭菌平皿中切取约1-2cm发根10根约0.5g，接种到灭菌冷却后的500ml三角瓶中，25℃摇床110rpm培养。备注：若需固体培养保存发根，在液体培养基中加入12g/L琼脂即可。1.3.3生长数据及曲线绘制

每组接种15瓶（视情况可适当缩减瓶数最少10瓶）视发根提供量灵活掌握，起始接种量不用精确，每隔5天（周期30-35天），取10（或6）瓶测定发根湿重（在无菌室或超净台上，用灭菌镊子取出，在灭菌滤纸上吸干，于灭菌平皿或滤纸上称量，注意去皮），称量后继续放回原三角瓶培养。若发根后期量大不好用镊子取出则用灭菌移液器把液体抽出，称重发根和三角瓶总重后再把培养液放回，这一步一定要注意在装培养基前称量三角瓶的重量并编号记录。

数据用3次平均后记录并以时间d为横坐标发根湿重为纵坐标绘制生长曲线(理论上培养3瓶即可，多测定几瓶主要考虑的是操作染菌裕度）。并依据含水率绘制干重曲线。图4生长曲线例图1.3.4仪器及试剂试剂耗材备注仪器备注1/2MS培养基、蔗糖

三角瓶500ml及封口膜和绳

酒精棉球

平皿90

圆形滤纸和平皿配套

手术刀及刀架

称量纸、灭菌包裹用纸，如报纸或锡纸

医用镊子、玻璃棒、容量瓶、胶头滴管、移液管、试剂瓶

pH试纸精密含5.8

精密电子秤

蒸馏水、无水乙醇

摇床

口罩

无菌室或超净台、酒精灯、打火机

灭菌锅

吹洗瓶

标签、铅笔，标记笔等标记工具

表1.1发根培养所需试剂仪器2.人参发根总皂苷提取及含量分析2.1实验的目的意义（1）掌握植物组织（发根）生物活性物质皂苷提取的基本步骤；（2）掌握分光光度仪测定生物活性物质皂苷的基本操作。2.2实验原理（1）利用皂苷可溶于有机溶剂酒精，把皂苷从发根中通过回流提取到酒精中。（2）香草醛比色原理：高氯酸将甙元的酚羟基氧化为羧基,增加1个双键结构,再经双键位移,双分子缩合等反应生成共轭双键系统,又在酸的作用下形成阳碳离子盐而显色，从而用比色法测定。1.4.1皂苷提取（1）发根用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干发根表面水分；烘箱烘干至恒重60oC（约3h），粉末置于干燥器中干燥保存备用。备注：这一步最好与前一部分最后实验衔接好时间。（2）干燥的发根研钵细细研磨成粉末，精确称取1g粉末，置入试管，配置并加入70%酒精20mL，70oC水浴回流提取3h。（3）放置冷却至室温，800rpm离心3min，取上清液，双层滤纸过滤，用70%酒精和容量瓶重新定容到20mL。（4）取2ml提取液置入试管或比色管水浴80oC挥去乙醇后（约30-60min，成膏状即可），按标准曲线里的比色法测定皂苷含量，依据回归方程计算含量。同时另取2ml同法挥去乙醇，用甲醇重定容到1ml，为最后一部分的色谱分析提供待测样品。（做3组平行数据平均，也就是取3次2ml进行实验）2.2标准曲线制作（1）精准称量人参皂苷Re标准品10mg，后加甲醇定容至5mL，加水稀释成0.5mg/mL标准液。（昂贵药品5组做1次即可）（2）精准称量标准品溶液0mL、0.04mL、0.08mL、0.12mL、0.16mL、0.20mL放在比色管或具塞试管中挥干（50度-20-30min）。（3）取准备好的5%(5g/100ml)的香草醛冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，并将其移取至6支挥干的具塞试管之中，保持65℃的恒温，加热，取出用自来水降温3min，加入冰醋酸5mL，混匀，放置5-10min。（4）在波长546nm处检测吸光度。将吸光度（A）作为纵坐标，标准溶液Re的浓度（C）为横坐标，绘制出标准曲线，得出回归曲线方程。*****注意：3组平行数据的平均，和空白对照***。2.3试剂及仪器表2.1发根皂苷分析需试剂仪器试剂备注仪器备注无水乙醇

圆底烧瓶、研钵、洗瓶

人参皂苷Re

冷凝回流管及配套胶管和圆底烧瓶配套冰醋酸

水浴锅、分光光度仪、电子秤

香草醛

烧杯

高氯酸

比色管或具塞试管、试管架

甲醇

容量瓶5ml，20ml

蒸馏水

移液管、移液枪

烘箱、干燥器、及干燥剂

小型抽滤装置及漏斗和配套滤纸

3.皂苷液相色谱分析3.1实验目的意义（1）掌握液相色谱分析生物活性物质皂苷的基本原理及操作3.2实验原理

利用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分移动速度不同而被分离，分离后依次进入检测器进行定性或定量检测，从而实现对试样的分析。图5液相色谱分析流程3.3具体流程（1）称取0.5mg皂苷Re甲醇定容至1mL；用0.45µm膜过滤（注射式）；（2）准备流动相乙腈：水（19：81，v/v）300mL；用0.45µm膜过滤；（3）开机，流动相接入排气，2min冲洗5.0ml/min；（4）按色谱条件设定参数，柱温：25℃，检测波长：203nm，流速：1.0mL/min；（5）上样10μL，自动数据采集，注意观察Re的峰值，此外做一组空白对照(甲醇10μL)分析；依据空白对照，找出Re峰，并记录标准峰出峰时间和峰面积。（6）取前述2ml提取液挥干物质，甲醇重定容1ml，膜过滤后取10μL上样，对照标准峰，计算皂苷含量。（7）用纯甲醇试剂冲洗系统，1.0ml/min冲洗40分钟后，关机。含量计算：

标准品浓度C1，进样量体积V1，得到一定的液相峰面积S1；待测样品进样量体积V2，得到一个峰面积S2。图6色谱峰3.4试剂仪器表3.1发根皂苷色谱分析需试剂仪器试剂备注仪器备注乙腈

注射过滤器

甲醇

微膜大量过滤器0.45µm膜

0.45µm膜

色谱柱和液相色谱仪

人参皂苷Re

电子秤

4.注意事项（1）严格遵守实验室规章，仪器设备操作要按照实验室老师的要求和规程进行。操作过程要仔细认真。（2）安全：操作过程要仔细谨慎避免试剂特别是有毒试剂（如本实验中的甲醇、乙腈）误入口中或撒溅到眼睛、皮肤或衣服上，试剂瓶上都标有毒性级别，应注意。应佩戴口罩。废弃物处理要科学规范。无菌室或超净台必须关闭紫外线后再行操作，烘箱需有人值守避免起火。（3）发根培养是无菌培养，要注意每个操作环节的无菌要求，避免染菌。（4）提前预习，每次实验前规划好细化的实验步骤、方法,并把握实验每一细节。班长负责分组，组长负责各人分工，配合协作完成任务。（7）数据记录及处理：每个实验节点的实验数据、实验现象（最好图片记录）都要实时、实事求是的记录；养成科学严谨的态度。不得捏造和篡改实验数据，发现者直接计零分。

皂苷分析必须做空白对照Control。&实验数据应为3次或以上的平均值。第二部分设计性实验1.设计性实验题目及主要步骤1.1设计性实验的题目：（1）植物发根诱导；（2）培养条件对植物发根主要活性物质含量的影响。两个题目任选其一，完成《设计性实验项目申请书》,字数不少于3000。1.2步骤概要：

（1）查阅相关文献选定具体题目：如“桔梗发根诱导”、Tween-80对柴胡发根皂苷含量的影响”等。（2）充分阅读文献，设计实验方案，按实验教学中心提供的项目申请书模板充实相关内容。（3）

按格式完成实验项目申请书（结合申请书模板讲解）。

特别说明：参考文献要按国标引用和列出。

可以用参考文献管理软件，如