引起仔猪腹泻的致病性大肠杆菌分离及鉴定

目录中文摘要……………ⅠAbstract……………Ⅱ引言……………………11材料与方法…………41.1材料………………41.2方法………………41.2.1细菌的分离纯化………………51.2.2细菌的鉴定……………………61.2.3药敏试验………………………72结果…………………82.1细菌的分离培养和形态学观察…………………82.2生化鉴定…………92.3PCR鉴定…………92.4药敏试验………………………103讨论………………13致谢…………………14参考文献……………15图1细菌在麦康凯培养基上的形态………………8图2革兰氏染色后显微镜下的形态………………9图3987P引物片段扩增结果……………………10图4药敏试验抑菌圈……………11表1上、下层普通营养琼脂培养基以及营养肉汤培养基配料表………………5表24种致病性大肠杆菌毒力基因PCR引物………7表3分离菌株的生化鉴定…………9表4分离菌株药敏试验结果……………………11引言大肠杆菌（Escherichiacoli），又叫大肠埃希氏菌，属于肠杆菌科埃希氏菌属，是短杆菌，它的两端呈钝圆形，大小一致，革兰氏染色下呈现红色，为革兰氏阴性菌，一般情况下多是单一或两个存在，但不会排列成长链。大多数的大肠杆菌具有荚膜，但是不能形成芽孢，多数的大肠杆菌菌株长有菌毛。在不同的培养基上大肠杆菌呈现的生长情况也不一样，在普通琼脂平板上会长出灰白色的露珠样的光滑、隆起、边缘整齐的菌落，在麦康凯培养基上，会长出红色圆形菌落，在伊红美蓝琼脂平板上会长出带金属光泽的紫黑色菌落，在三糖铁琼脂培养基上会呈现出斜面底部为黄色，产生气体的现象。大肠杆菌的生化代谢是很活跃的。大肠杆菌可以发酵葡萄糖，绝大多数产酸产气，还可以发酵很多种碳水化合物，也可以利用多种有机酸盐。在常用生化特性检测项目中，甲基红试验呈阳性，吲哚试验为阳性，尿酸酶和氧化酶呈阴性，柠檬酸盐利用呈阴性。根据这些形态学特征和生化特征可以对大肠杆菌进行初步的鉴定。大肠杆菌的种类很多，采用不同的分类方法可将其分为不同的类型。按照致病作用进行分类，可分为致病性大肠杆菌和非致病性大肠杆菌，其中致病性大肠杆菌主要有六类，即能够致使胃肠道感染的肠道致病性的大肠杆菌(EPEC)、肠道产毒素性的大肠杆菌(ETEC)、肠道侵袭性的大肠杆菌(EIEC)、肠道出血性的大肠杆菌(EHEC)、肠集聚性的大肠杆菌(EAEC)以及近年来发现的肠产志贺样毒素同时具有一定侵袭力的大肠杆菌(ESIES)。另外，还有能够致使尿道感染的尿道致病性的大肠杆菌(UPEC)，以及最新命名的肠道集聚性的黏附大肠杆菌(EAggEC)REF_Ref18915\r\h[1]。按溶血性来分，根据大肠杆菌的感染性状能否产生溶血素和有无溶血的能力，可将大肠杆菌分为两大类:即溶血性的大肠杆菌和非溶血性的大肠杆菌REF_Ref18915\r\h[1]。另外，按产肠毒性分类，根据大肠杆菌在感染过程中能否产生肠毒素，将大肠杆菌分为产肠毒素性的大肠杆菌和非产肠毒素性的大肠杆菌REF_Ref18915\r\h[1]。大肠杆菌是自然界中普遍存在的一种细菌，在人和动物的体内和体外均存在，但一般不导致疾病的发生，属于在动物肠道内的正常寄生菌，只有少数产肠毒素的大肠杆菌会导致人和动物的肠道疾病，属于人畜共患病。在养殖行业中，主要感染猪，鸡等家畜家禽，是非常严重的致病菌，危害幼龄动物，而且发病率高，致死率也高，对养殖行业危害非常大，令养殖户和猪场损失严重。致病性大肠杆菌能引起温血动物的腹泻，主要表现肠炎、肠毒血症等多种临床症状。仔猪黄白痢发生于1周龄内初生仔猪拉黄痢和30日龄内仔猪拉白痢为特征的急性致死性传染病REF_Ref23306\r\h[2]。仔猪黄痢发病的集中日龄在1～7日龄，通常是出生几小时至１周龄的新生仔猪易发，尤其是1～3日龄最易发病，其中初产青年母猪所产的仔猪更容易发病。在一窝新生仔猪中，刚出生后的体温正常，短时间内就会突然有1～2头表现出明显衰弱，快速死亡，随后其他仔猪陆续出现发病，排出黄白色或者黄色的浆糊状稀便，其中混杂凝乳碎片，体型快速消痩，最终死亡REF_Ref25034\r\h[3]。仔猪白痢的发病日龄为10～30日龄，主要特征是下痢，排出灰白色或者乳白色的糊状稀粪，并散发腥臭味。病猪往往突然持续腹泻，机体日渐消痩，发育减缓。部分能够自愈，但往往反复发作，容易变为僵猪REF_Ref25034\r\h[3]。仔猪的水肿病也是由大肠杆菌引起的，通常是断奶前后仔猪易发，主要特征是突然出现发病，头部发生水肿，共济失调，惊厥以及麻痹。通常是脸部、眼睑、结膜以及齿龈发生水肿，有时可见颈部、腹部皮下也发生水肿REF_Ref25034\r\h[3]。通常不会整窝出现发病，发病率较低，一般在4%左右，但死亡率能够达到80%～100%，且康复率非常低，目前还没有研制出特异性药物REF_Ref13177\r\h[4]。这三种大肠杆菌导致的疾病，在新生仔猪时期非常常见，由于新生仔猪免疫系统还没有健全，对环境的适应也相对较差，只能依靠母乳中的免疫球蛋白，来构成自身的免疫系统，这样的免疫系统非常不坚固，所以给各种病原菌提供了可乘之机，再加上有些猪场管理条件稍差，卫生条件差，不能及时清刷猪舍，更是让细菌有了可藏身之处，又如天气条件不适当，寒冷，大风，暴雪，暴雨，高温，炎热等，都会给新生仔猪造成应激，更是减弱了免疫力，使得大肠杆菌更容易侵入仔猪体内，造成仔猪的机体紊乱，最终进入肠道，释放出肠毒素，侵入肠上皮，破坏肠上皮细胞正常的功能代谢，造成肠上皮细胞功能紊乱，最终影响仔猪的消化系统，是消化系统功能异常，不能正常的消化食物，导致腹泻，造成仔猪的消化不良，伴随着营养不能及时吸收，使仔猪机体没有足够的营养来保持代谢正常，不能为机体各项生命活动提供营养，最终导致消瘦，严重的腹泻还会造成机体脱水，而脱水到达一定程度，会引起仔猪的死亡，更严重的是，大肠杆菌病是一种传染病，而且传染性非常强，所以仔猪的黄白痢通常是由一只发病，逐渐散播到几只，然后是一窝全部发病，接着会牵连到相邻的小猪，导致大量新生仔猪死亡，造成严重的损失，这些损失，对养猪企业来讲，可能只考虑它带来的经济损失，因为养猪企业拥有大量的猪只，这些仔猪的死亡在企业的弹性范围内，而对于普通养殖户来讲，这些仔猪的死亡带来的不仅仅是经济上的损失，还有人力上的损失，物力上的损失，精力上的损失，一头母猪从发情开始，要悉心照顾，到适配时期要抓住时机，才能配种成功，经历大约114天的妊娠期，这期间要保证充足的营养，在分娩时还要保重仔猪顺利的产出，还有可能遇上死胎、木乃伊胎的出现，最终产出十几头小猪，而这些小猪的健康是养殖户数月来辛苦的回报，而仔猪的大肠杆菌病严重时，会使一窝小猪全部夭折，是养殖户数月的辛苦劳作全部化为灰烬，饲料，兽药，疫苗等，这些损失，以及在分娩的夜晚不能休息的精力耗费，这所有的损失，都对养殖户的打击非常大，所以，大肠杆菌病对养殖业的危害相当大。由于大肠杆菌在自然界内分布极为广泛，所以大肠杆菌病的分布也是非常广泛的，在世界范围内都有分布，在流行性上，大肠杆菌病还是有一定的区域分布特征的，这也不难理解，在养殖业发达的地区和国家，流行性高，而在养殖稀少的地方，大肠杆菌病的流行性低，这主要还是因为各个国家与地区的经济条件，社会卫生状况等等，都不尽相同，所以才会是大肠杆菌病的流行产生区域差别。当然，这也与各个地区和国家的科技发展水平有关，在科技发展水平高的地区或国家，在养殖业方面，大量的机械化设备代替了人力，既提高了工作效率，还扩大了防疫监控范围，使得各种病菌都少了可乘之机，而在科技发展水平低一些的地区或国家，还是依靠人力，或者半机械化，防疫做的不全面，自然流行病的流行性更强一些，所谓科技是第一生产力，还是非常有道理的。在时间上，大肠杆菌病的发病特征并不是非常明显。主要体现在它的季节发病性上，大肠杆菌病在一年四季都有发生，在同种群体之间，它的季节发病性稍明显，但在不同种群体之间是存在一些差异的。大肠杆菌病在猪身上一年四季都可以发生，主要在环境低温高湿的时候，如冬春季节温度较低，阴雨天气湿度较大，仔猪抵抗力减弱，肠道内的致病菌往往会大量增殖，从而引起发病REF_Ref25034\r\h[3]。此外，还有猪的日龄有关，前面提到大肠杆菌病的危害时说到，仔猪黄痢通常在出生后几天发生，仔猪白痢主要在14～21日龄发生，猪水肿病往往在42～105日龄发生REF_Ref13177\r\h[4]。而大肠杆菌病的传播源主要是粪便中的致病性大肠杆菌，传播途径主要是粪口传播。所以日常的清理粪便以及粪便的生物热处理非常重要。为了确定烟台海阳某猪场这起仔猪腹泻是否为大肠杆菌引起的，本实验对该猪场采集的棉拭子样品进行了细菌的分离纯化、革兰氏染色镜检、生化试验、PCR鉴定、血清型鉴定以及药物敏感性检验。1材料与方法材料病料病料采集自海阳某猪场疑似大肠杆菌病的腹泻仔猪的粪便及肛门拭子，共48份。材料及试剂普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、营养肉汤培养基（LB肉汤）、革兰氏染色剂、细菌微量生化鉴定管、96孔酶标板、Tris-乙酸电泳缓冲液（50×TAE缓冲液）、Goldview核酸染色剂、双蒸水、4种毒力基因的上、下游引物，采购于深圳华大基因科技有限公司，包括E.coilK88-F841bp、E.coilK88-R841bp、E.coilK99-F543bp、E.coilK99-R543bp、E.coil987P-F463bp、E.coil987P-R463bp、E.coilF41-F682bp、E.coilF41-R682bp以及16SrRNA引物一共9种引物，购置于南京诺唯赞生物科技有限公司的2×TaqPCRMasterMix、购置北京天坛药物生物技术开发公司的药敏纸片。设备SW-CJ-2F型双人双面净化工作台、BPH-9162型精密恒温培养箱（37℃）、HYC-356型医用冷藏箱（2-8℃）、CX31RBSF型电子显微镜、DW-25L262型医用低温保存箱（-25℃）、A300型基因扩增仪、WD-2102B型全自动酶标仪、JY04S-3E型凝胶成像分析系统、300E型电泳仪、TGL-20M型高速冷冻离心机、THZ-100型恒温培养摇床、H1650-W型医用离心机、JM-A6002型电子天平、GW-T7型电陶炉、ML204T型电子天平（精密）、量筒（50ml、100ml、1000ml）、HWS-26型电热恒温水浴锅、MX-F型涡旋机、MINI-6000型微型离心机、移液器（100-1000µl、20-200µl、0-100µl、5-50µl、0.5-10µl、0.1-2.5µl）、30-300µl的排枪、接种环、试管架、枪头等。方法细菌的分离纯化配制培养基在烧杯中按照试剂说明比例加入试剂充分混合，然后将烧杯放置在电陶炉上加热，边加热边搅拌，防止琼脂糊底，待琼脂溶解后，分装到相应的锥形瓶中，不超过最大容积的三分之二。塞上橡胶塞，包裹上牛皮纸，用橡皮筋缠起来，然后放入高压灭菌锅中，121℃高压灭菌30min，再拿出来冷却，最后在无菌条件下，倒入干燥已灭菌的平板中即可。下层培养基的配制基本相似，将上层培养基配料中的琼脂粉减半即可，加热之后趁热分装到试管中，每支试管中5ml，塞上橡胶塞之后，7支试管一扎，用牛皮纸和橡皮筋包扎好高压灭菌。营养肉汤中不加琼脂粉，所以也就不需要加热，配料完成后，包扎好，直接高压灭菌即可。配料表如表1:表1上、下层普通营养琼脂培养基以及营养肉汤培养基配料表成分上层普通营养琼脂培养基下层普通营养琼脂培养基营养肉汤培养基牛肉浸粉3g3g3g琼脂粉15g8g-蛋白胨粉10g10g10g氯化钠5g5g5g蒸馏水1000ml1000ml1000ml细菌的分离将超净台台面用酒精消毒，并且打开紫外灯杀菌20min。灭菌完成后，用75%的酒精消毒双手。开始操作，点燃酒精灯，将镊子放在酒精灯上来回灼烧几次杀菌，然后打开样品管，用镊子夹取出棉拭子，涂布在培养皿上，并进行编号，然后放入37℃恒温箱中24h后观察。细菌的纯化待涂布好的培养皿上长出单菌落后，用灭菌的接种环挑取疑似大肠杆菌的单菌落进行纯化。用接种环在麦康凯培养基上进行划线，分三区划线，画完线的平板放入37℃恒温箱中，等长出单菌落后，再次挑取单菌落在麦康凯培养基进行划线分离纯化。这样重复3次，直到菌落完全纯化，挑取单菌落到5mlLB肉汤试管中，在37℃恒温摇床中过夜培养12h。细菌的鉴定革兰氏染色镜检对纯化好的单菌落进行革兰氏染色。首先将载玻片洗净擦干，在灼烧杀菌，然后在载玻片中央滴一滴生理盐水，用灼烧冷却后的接种环挑取单菌落，在生理盐水中涂匀，用酒精灯烤干固定，然后拿出革兰氏染色剂中的草酸铵结晶紫，滴1滴，染色1min，1min后，用蒸馏水冲洗，然后再用碘液染色1min，1min后，用蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去水分，用95%的酒精数滴进行酒精脱色，30s后，水洗，吸水，最后用沙黄1滴，染色1min，然后用蒸馏水冲洗，再用吸水纸吸干水分。干燥后镜检，油镜下观察细菌形态。细菌的生化鉴定用糖发酵试验，选取葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇5种细菌微量生化鉴定管对分离菌株进行生化特征鉴定。在无菌环境下，用灼烧冷却后的接种环挑取适量的、待检验菌苔于生理盐水中，混合均匀，制备细菌悬浊液。用移液器分别取100µl细菌悬浊液加入5种细菌微量生化鉴定管中，在37℃培养18～24h后，观察颜色变化，并与鉴定标准进行对比REF_Ref23841\r\h[5]REF_Ref31863\r\h[6]。PCR鉴定首先是大肠杆菌特异性引物的鉴定。根据深圳华大基因科技有限公司研发的大肠杆菌特异性鉴定引物，EC370-F：5，-GATAAGCCCGCAGTCACCT-3，，EC370-R:5，-TCCCGTAACTCATCACCATCA-3，，对分离的各细菌菌株进行鉴定。用菌液做DNA模板，配制成25µl的PCR反应体系。其中需要上游引物1µl，下游引物1µl，DNA模板2µl，双蒸水8.5µl，2×TaqPCRMasterMix12.5µl。将反应体系混合均匀，用瞬时离心机瞬离，按照95℃预变性5min，开始循环：94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸55s，30个循环，最后72℃总延伸10min，终止反应20min。最后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，预期扩增的目的片段大小为370bp。量取100ml1×TAE缓冲液于烧杯中，称取1g琼脂糖放入其中，用电陶炉加热融化直到液体清亮，将其冷却到40-60℃，再用移液器取5µl核酸染色剂，摇晃混合均匀，在凝胶盘中放好凝胶板，事先根据样品数量需要放入梳子，将配好的胶倒入凝胶盘中，使胶板的厚度大约为5mm，放置30min，制备成1.0%琼脂糖凝胶。胶板冷却凝固后，拔出梳子，将凝胶连同凝胶板放入水平电泳槽，倒入1×TAE缓冲液淹没胶面。PCR反应完成后，各取5µlPCR扩增产物加入到各个加样孔中，并且加入阳性对照，同时加入标准分子量Maker做分子质量大小对照，在120V电压下电泳20min。在电泳结束后，关掉电源，取出凝胶，放进天能凝胶成像系统中，打开其中的紫外灯，辅助其余的灯光，观察条带。由于TAE缓冲液具有一定的毒性，所以在配制1×TAE缓冲液，1.0%琼脂糖凝胶，以及电泳，取胶时，应该全程佩戴橡胶手套，必要时可戴两层，操作完成后，要洗手清洁。其次是大肠杆菌血清型的鉴定。根据刘泽文REF_Ref25544\r\h[7]等报道的大肠杆菌K88，K99，987P，F41四种毒力基因（表2），进行大肠杆菌的血清型鉴定。以菌液为模板配制成25µl的PCR反应体系，进行PCR反应。反应条件按照95℃预变性5min，开始循环：94℃变性30s，设置48℃-48℃-46℃-45℃的梯度退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃总延伸10min，终止反应20min。扩增完成后，进行电泳，观察条带。表24种致病性大肠杆菌毒力基因PCR引物毒力基因种类序列长度退火温度K88F：GATGAAAAAGACTCTGATTGCAR：GATTGCTACGTTCAGCGGAGCG841bp45℃K99F：CTGAAAAAAACACTGCTAGCTATTR：CATATAAGTGACTAAGAAGGATGC543bp46℃987PF：GTTACTGCCAGTCTATGCCAAGTGR：TCGGTGTACCTGCTGAACGAATAG463bp54℃F41F：GATGAAAAAGACTCTGATTGCAR：TCTGAGGTCATCCCAATTGTGG682bp45℃药敏试验采用药敏纸片法对分离得到的菌株做药物敏感性测定。在无菌条件下，用移液器取100µl经纯培养的菌液，置于琼脂平板内，用一次性涂布棒将菌液涂布在琼脂培养基表面上，每次将平板转动一些角度，稍稍倾斜，涂布棒要涂布到平板的边缘，以保证菌液涂布的均匀，等待平板上的水分完全被吸收之后，贴上药敏纸片[8]。用酒精灯灼烧过的冷却后的无菌镊子夹取出药敏纸片（头孢噻肟、恩诺沙星、青霉素、新霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、氨苄西林、庆大霉素一共9种药敏纸片）分别平贴在琼脂表面，用镊子轻轻按压，保证贴紧，但不要将琼脂戳破。每个琼脂平板上贴5张不同的药敏纸片，各个纸片的间距不能少于25mm，每张纸片的中心离平板边缘不少于15mm。将操作完的平板反扣过来，放置在37℃恒温温箱中培养18～24h，然后取出，从平板背面测量抑菌圈的直径[9][10]。结果细菌的分离培养和形态学观察经37℃恒温培养24h后，可以看见在普通琼脂上形成圆形菌落;在麦康凯培养基上形成圆形粉红色菌落，可见表面光滑、扁平、凸起，经过连续传代培养后菌落大小均一样（图1）。革兰氏染色镜检发现染色的菌体呈红色，为革兰氏阴性菌，且单一或两个存在，两端钝圆的短杆菌，因此初步判断为疑似大肠杆菌（图2）。图1细菌在麦康凯培养基上的形态图2革兰氏染色后显微镜下的形态生化鉴定5种糖发酵试验结果显示，分离到的菌株能够在葡萄糖、乳糖、麦芽糖以及甘露醇发酵管中产酸产气，不能利用蔗糖（表3），根据生化反应结果判定为大肠杆菌。表3分离菌株的生化鉴定生化鉴定项目鉴定结果葡萄糖+乳糖+麦芽糖+蔗糖-甘露醇+PCR鉴定用PCR方法检测分离菌株的K88、K99、987P、F41四种血清型的鉴定，分离所得到的48株菌株均未扩增出K88、K99、F41的目的条带，其中有2株细菌用987P引物扩增出了目的条带，大小为463bp（见图3）。250bp500bp2000bp250bp500bp2000bp250bp500bp2000bp250bp500bp2000bp图3987P结果M：DNA标准分子质量为DL20001-48：48个样品的DNA扩增结果药敏试验用药敏纸片扩散法对48株菌株进行耐药试验，并根据《欧盟药敏试验标准》进行判定。根据药物敏感性测定的结果判断菌株对头孢噻肟、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星敏感，对青霉素、新霉素、多西环素、氨苄西林、庆大霉素耐药。药敏试验抑菌圈见图4，48株细菌对各种药物的敏感度见表4。图4药敏试验抑菌圈表4分离菌株药敏试验结果菌株编号头孢噻肟恩诺沙星青霉素新霉素环丙沙星多西环素左氧氟沙星氨苄西林庆大霉素1++--+-+--2++--+-+--3++--+-+--4++--+-+--5++--+-+--6++--+-+-+7++--+-++-8++--+-+--9++--+-+--10++--+-+--11++--+-+--12++--+-+--13++--+14++--+-+--15++-++-16++--+-+--17++--+-+--18++--+-+--19++--+-+--20++--+21++--+-++-22-+--+-+-+23++--+-+--24++--+-+--25++--+-+--26++--+-++-27+++--28++--+-+--29++--+-++-30++--+-+--31++--+-+--32-+--+-+-+33++--+-+--34++--+-+--35++--+-+--36++--+-+--37++--+-+--38++--+-+--39++--+-+-+40++-+--41++--+42++--+-++-43++--+-+--44++--+-+--45++--+-+-+46++--+-+--47++--+-+--48++--+-+--注：“+”表示敏感，“-”表示耐药。讨论仔猪感染大肠杆菌会导致仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪水肿病，致使仔猪食欲降低，精神状态不良，生产性能下降，严重的引起仔猪大量死亡，造成严重经济损失。本实验从烟台海阳某养猪场采集的仔猪腹泻样品中分离到大肠杆菌菌株，并对其进行了革兰氏染色镜检，生化鉴定，PCR鉴定，以及药物敏感性测定。在实验中遇到了许多问题。猪源致病性大肠杆菌的血清型主要有K88、K99、987P、F41四种类型。本试验在PCR鉴定的过程中，K88和K99两组的阳性对照没有出现条带，怀疑K88和K99标准株的序列发生变化，送到机构检测，发现这两株菌没有黏附素基因。所以只鉴定到2株987P血清型的大肠杆菌，其它菌株的血清型有待鉴定。福建农林大学的余佳REF_Ref15937\r\h[11]分离到了F41型的大肠杆菌，湖北的刘泽文等REF_Ref30971\r\h[7]987P型的大肠杆菌，可见不同地区的致病性大肠杆菌血清型存