分子生物学检验技术第一章分子生物学检验技术绪论课件

分子生物学检验技术Molecular

Biology

Diagnosis2025年4月12日绪论分子生物学检验诊断的概念定位分子生物学检验诊断的发展分子生物学检验诊断技术发展分子生物学检验诊断技术应用分子生物学检验诊断技术存在的问题分子生物学检验诊断技术的标准化2025年4月12日分子生物学检验诊断的概念定位临床诊断影像学诊断实验室检验诊断（临床检验诊断）疾病的诊断病史体格检查CT核磁共振微生物检验

生化、免疫诊断

检验诊断血液、临检检验诊断分子生物学检验诊断B超辅助检验2025年4月12日实验室检验诊断“第一代检验诊断”早期，细胞形态学检验诊断“第二代检验诊断”20世纪50年代，生物化学检验诊断“第三代检验诊断”20世纪60年代，免疫学检验诊断“第四代检验诊断”20世纪70年代末，基因检验诊断（分子生物学检验诊断）以疾病的表型改变为依据非特异、滞后难以早期诊断以疾病基因为探测对象特异、敏感早期诊断、预测2025年4月12日窗口期：HBV 56天（缩短6-15天）HCV 70天（缩短41-60天）第四代检验诊断第三代检验诊断701232

562025年4月12日分子生物学检验的对象：生物分子（biomolecule）生物大分子DNA/RNA蛋白质

生物小分子代谢物生物标志物（biomarker）CellNucleusChromosomeProteinGene

(mRNA),

Gene

(DNA)single

strandMetabolome2025年4月12日2025年4月12日生物标志物（biomarker）反映异常信息的标志物（分子、细胞、表型，等）因人体暴露在污染的环境中等引起异常因人体发生疾病而导致异常指标异常，表现在：细胞分子结构和功能的变化某一代谢过程的变化或生成异常的代谢产物或其含量异常某一生理活动或某一生理活性物质的异常表现个体表现出的异常表型（现象）筛选原则：特异、灵敏、稳定、可重复、无损生物标志物的应用用于疾病诊断、判断疾病分期、分型用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性2025年4月12日分子生物学检验诊断的发展分子生物学（molecular

biology）分子医学（molecular

medicine）基因诊断（gene

diagnosis）分子生物学检验诊断（molecular

diagnosis）•1953，Watson

&

Crick，DNA双螺旋结构模型•70年代以来，成为生命科学最具活力的学科前沿•分子生物学理论和技术方法广泛地被应用于临床•分子生物学与医学的交叉和渗透，产生了分子医学•70年代末，美籍华裔科学家Kan

Yuet-Wai•液相DNA分子杂交，镰形细胞贫血症的基因诊断•标志着检验诊断进入基因诊断时代1953，Watson

&

Crick，DNA双螺旋结构模型70年代以来，成为生命科学最具活力的学科前沿分子生物学理论和技术方法广泛地被应用于临床分子生物学与医学的交叉和渗透，产生了分子医学70年代末，美籍华裔科学家Kan

Yuet-Wai液相DNA分子杂交，镰形细胞贫血症的基因诊断标志着检验诊断进入基因诊断时代2025年4月12日分子生物学检验诊断的发展1999年11月American

Societyfor

InvestigativePathologyThe

Association

forMolecular

Pathology《The

Journal

ofMolecularDiagnostics》标志着基因诊断技术发展成为分子生物学检验诊断SCI

收录2005年IF2.8852006年IF2.9012007年IF3.4782008年IF

3.6432009年IF3.4132010年IF4.2192011年IF

3.5762012年IF3.9522013年IF3.955分子生物学分子医学基因诊断分子诊断2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展第一阶段以基因突变位点（导致单基因遗传病）为靶标核心技术：DNA分子杂交技术第二阶段以基因组特异性核酸序列（DNA、RNA）为靶标核心技术：PCR技术第三阶段以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子为靶标核心技术：biochip

技术（高通量）第四阶段（高灵敏度、高特异性、高通量化、高自动化）以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子、代谢物为靶标核心技术：新一代测序技术、质谱技术2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展——技术驱动以DNA分子杂交技术为基础的检验诊断方法遗传病的基因诊断以PCR技术为基础的检验诊断方法获得性基因病（病原微生物）的基因诊断以生物芯片（biochip）技术为代表的高通量密集型技术的检验诊断方法复杂性疾病（多基因多因素疾病）的分子生物学检验诊断以二代测序技术为基础的大数据分析2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展——主要驱动技术PCR技术：实现了痕量核酸模板的体外扩增，提高了检测灵敏度和反应特异性2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展——主要驱动技术荧光定量PCR/real-time

PCR：实现了核酸的实时定量检测（从定性到定量）SYBR

green

I

（荧光染料）Taqman

技术（荧光探针）Molecular

beacon2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展——主要驱动技术核酸测序技术，分子检验诊断（序列确定）的金标准高通量长片段测序方法第一代：双脱氧末端终止法第二代：焦磷酸测序法Next

generation

（第三代）Human

genome:

1,

000

USD;

1h2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展——主要驱动技术生物芯片（biochip）技术，将大量基因探针／基因片段／蛋白／多肽按特定的排列方式固定在玻片（硅片、塑料片）上，实现了高通量筛查2025年4月12日Biochip生物芯片工作原理2025年4月12日基因表达谱疾病诊断药物筛选新基因寻找重测序基因分型基因突变遗传作图基因芯片应用2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展——主要驱动技术芯片实验室（laboratoryon

chip）将许多不连续的分析过程，如样品制备、核酸标记、生化反应、分离检测及数据处理等，通过采用半导体光刻加工等缩微技术，集成到一块生物芯片上，形成便携式生物化学分析系统实现了全自动化样品导入试剂样品制备检测化学反应2025年4月12日School

of

Laboratory

Medicine,

Wenzhou

Medical

College分子生物学检验诊断技术发展——主要驱动技术蛋白指纹图谱技术，实现高通量、高效率、高灵敏度和自动化分析筛查蛋白芯片技术飞行时间质谱技术DetectorTOF-MSTrace

ViewGel

ViewMap

View化学表面–蛋白质表达剖析:(金属离子)(正相亲水)(反相疏水) (阴离子) (阳离子)(PS-1orPS-2)(抗体–抗原)(受体-

配体)

(DNA

–

蛋白质)生物表面–蛋白质相互作用检测:2025年4月12日25005000750010000125002500500075001000012500Ret

Map

1-4Ret

Map

1-3Ret

Map

1-4(2)Ret

Map

1-3(2)comp1064234467.64843.6+H6226419.116605.277700.057908092.4+H871890692279975.502643028.2+H399444696226422.126615.947517699.228098.468908.669404.620-2.57.552.5Difference

mapPatientControlGelViewTM蛋白芯片——蛋白指纹图2025年4月12日胃癌蛋白指纹图45005000550060004500500055006000汤金高汤金高(2)0204060020406045005000550060004500500055006000汤金高汤金高(2)基本信息：蛋白指纹谱图：印象：检测到阳性的胃癌蛋白指纹（4595Da，5335Da，5898Da），根据治疗情况随诊，必要时复查。蛋白指纹图谱分析2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展方向①分子生物学检验诊断的内容从传统的DNA检验诊断发展到核酸及其表达产物（mRNA、蛋白质）和代谢产物的多层次水平的检验诊断与过程诊断DHPLC技术基因（产物）修饰甲基化乙酰化磷酸化代谢及代谢调控2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展方向②分子生物学检验诊断的策略从利用分子杂交、PCR等单一技术的检验诊断发展到有机组合多项技术（系统生物学技术链）的联合检验诊断2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展方向③分子生物学检验诊断的方法从定性检验诊断半定量、定量检验诊断核酸标记技术，特别是荧光标记技术的发展，荧光定量PCR技术等方法日益成熟定量质谱：通过三级四极杆或离子阱质谱（

MS/MS）实现第一个维度即单级质谱MS去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的MS（即MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯一的断裂。合并特异的母离子质量和唯一的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展方向④分子生物学检验诊断的范围从单基因疾病的检验诊断（孟德尔遗传性疾病，诸如：白化病、早老症、血红蛋白病、甲型血友病、囊性纤维化病、脆性X综合征，等）到获得性基因病的检验诊断（感染性病原体，诸如：HBV、HCV、HIV、HPV，等）到复杂性疾病（多基因病/多因素疾病）的检验诊断（如：肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病，等）2025年4月12日单基因遗传病与复杂性疾病2025年4月12日分子生物学检验诊断技术发展方向⑤分子生物学检验诊断的应用从治疗性检验诊断到疗效评价到预测性分析评价（疾病预警的分子靶标）预防性分析评价高危人群筛查疾病的分子分型2025年4月12日分子生物学检验诊断技术临床应用单基因病（孟德尔遗传性疾病）获得性基因病（感染性疾病）多基因（多因子）疾病细菌分型耐药性的分析疗效监控等2025年4月12日镰状红细胞贫血症的检测一种常染色体退化遗传病引起原因：基因的点突变丢失了可被Mst

II

切开的一个限制性内切酶位点正常：三条带患病：一条带子女1：正常子女2：患病子女3：携带者2025年4月12日分子生物学检验诊断技术临床应用遗传疾病分子生物学诊断检验项目全国各地普遍开展（遗传实验室）全国在浙江省试点，开展进行性肌营养不良基因检查肝豆状核变性基因检查甲型血友病基因检查性别基因（SRY）检测DNA测序项目2025年4月12日分子生物学检验诊断技术临床应用单基因病（孟德尔遗传性疾病）获得性基因病（感染性疾病）多基因（多因子）疾病细菌分型耐药性的分析疗效监控等2025年4月12日分子生物学检验诊断技术临床应用临床实验室开展的分子诊断项目（PCR、芯片）主要针对病原体的检测乙型肝炎病毒（HBV）；HBV

YMDD变异株结核分枝杆菌（TB）沙眼衣原体（CT）解脲支原体（UU）丙型肝炎病毒（HCV）人类巨细胞病毒（CMV）单纯疱疹病毒（HSV）人类白细胞抗原（HLA）人乳头瘤病毒（HPV）主要针对公共卫生问题SARS病毒RNA甲型H1N1流感病毒RNA2025年4月12日分子生物学检验诊断技术临床应用单基因病（孟德尔遗传性疾病）获得性基因病（感染性疾病）多基因（多因子）疾病细菌分型耐药性的分析疗效监控等2025年4月12日复杂性（多基因多因素）疾病疾病相关基因、基因表达、表达产物相互作用高血脂、高血压、肥胖、心脑血管等高血糖、糖尿病、肝病神经系统疾病衰老肿瘤2025年4月12日分子生物学检验诊断技术临床应用单基因病（孟德尔遗传性疾病）获得性基因病（感染性疾病）多基因（多因子）疾病细菌分型耐药性的分析疗效监控等2025年4月12日16SrRNA

基因作为细菌分型的目标基因16S

rRNA基因是细菌中稳定存在的看家基因所有细菌中普遍存在有固定不变的区域可设计测序引物有可变区域用于鉴别不同细菌类型16S

rRNA

Gene

Structure2025年4月12日16S

rRNA结构&引物位置0338F

&0357R0535R0776F

&0810R1174F

&1193R1087F

&1104R500bp

ID1540R1500bp0005F500bp

ID2025年4月12日分子生物学检验诊断技术临床应用单基因病（孟德尔遗传性疾病）获得性基因病（感染性疾病）多基因（多因子）疾病细菌分型耐药性的分析疗效监控等2025年4月12日病毒DNA聚合酶（Codon

552）YMDD突变检测与拉米夫定疗效评价野生株：Tyrosine-Methionine-Aspartate-Aspartate（YMDD）变异株1：Tyrosine-Valine

-Aspartate-Aspartate（YVDD）变异株2：Tyrosine-Isoleusine

-Aspartate-Aspartate（YIDD）2025年4月12日拉米夫定（Lamivudine）使用拉米夫定小于3个月，YMDD变异株很少出现当连续使用1年以上，YMDD变异发生率超过30%当停药后3－4个月，YMDD变异株下降，野生株又恢复优势。此时，病毒又对拉米夫定重新敏感因此通过检测突变就可以判断HBV对拉米夫定的敏感性，为临床用药提供有力的证据有资质的医院（卫生部临床检验中心验收合格的临床基因扩增实验室）可进行HBV

DNA定量和YMDD变异株检测2025年4月12日YMDD突变检测常见方法1.

基因测序法（金标准）2.荧光定量PCR方法基本原理确定探针特定的TM值来区分是否突变常用方法覆盖突变位点荧光双探针杂交YIDD46.91℃YMDD54.64℃YVDD50.74℃2025年4月12日分子生物学检验诊断技术临床应用单基因病（孟德尔遗传性疾病）获得性基因病（感染性疾病）多基因（多因子）疾病细菌分型耐药性的分析疗效监控2025年4月12日疗效监控（新药验证）拉米夫定抑制血清HBV

DNA0-20-40-60-80-100治疗周数拉米夫定安慰剂血清HBV

DNA;平均%变化0

4

8 12

16

20

24

28

32

36

40

44

48

52n=192n=404n=171n=359III期临床研究的综合数据2025年4月12日分子生物学检验诊断存在的问题假阳性问题假阴性问题重复性问题同一实验室不同检测批次间重复测定，结果存在差异不同实验室对同一标本检测，结果存在差异（不同实验室间结果的互认）2025年4月12日分子生物学检验诊断存在的问题原因：检测对象存在个体差异临床操作环节多，不易规范难以做质控标准品参考方法检测对象的多态性标本采集诊断试剂方法特异性敏感性重复性稳定性微量反应体系准确性测定操作（人员素质）仪器设备的维护校准（定期）数据处理及结果报告标准物质及质控物的应用2025年4月12日分子生物学检验诊断技术管理针对感染性疾病的病原体的分子生物学检验诊断，有严格的管理项目报批：卫生部批准实验室：通过验收，定期校验仪器与器材试剂：国家食品药品监督管理局（SFDA)批准工作人员：经过培训，持证上岗质量控制：室内质量控制（IQC），室间质量评价（EQA）针对遗传性疾病的分子生物学检验诊断？！针对复杂性疾病的分子生物学检验诊断？！2025年4月12日FDA将要干预疾病基因分子诊断

FDA将着重评估实验室自行设计的方法（in-house-developedgenetic

tests）和实验室资质等

FDA将对方法原理、实验步骤、使用指征、报告格式、结果、标本、临床有效性等因素进行论证，并在全美建立一个完善

的遗传学检验的质量控制体系，规定报告模式和反馈给被检

者的信息范围2025年4月12日分子生物学检验诊断技术的标准化临床标本采集、运送和保存的标准化临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化检测试剂和方法的标准化检测结果分析的标准化标准物质和质控物的应用临床实验室分子生物学检验诊断技术标准化诸要素间的关系2025年4月12日分子生物学检验诊断技术的标准化制定一个规范的临床标本采集、运送和保存的程序对参与该程序运行的相关人员进行必要的培训及时与临床科室进行全面而有效的“对话”工作沟通定期质量评价纠错措施一、临床标本采集、运送和保存的标准化2025年4月12日分子生物学检验诊断技术的标准化检测前对标本进行必要的预处理以去除干扰建立一个标准化的临床标本制备处理程序核酸提取纯化方法标准化的重要指标：核酸片段质量（完整性）核酸提取效率（原始数量）有效地去除干扰物质（PCR抑制物）二、临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化2025年4月12日分子生物学检验诊断技术的标准化组成一个可用于临床分子生物学检验诊断的试剂和检测方法模式试剂生产企业：在研发和生产试剂时，必须仔细考虑污染问题，假阳性和假阴性等因素，采用的检测方法（最理想）参考实验室（标准化实验室）：验证试剂和检测方法三、检测试剂和方法的标准化2025年4月12日分子生物学检验诊断技术的标准化定性测定结果确定的依据：在于阳性判定值（cut-off）的建立cut-off值：阴性结果的2-3倍定量测定的依据：是使用系列浓度标准品测得的剂量反应曲线（即标准曲线）或是内标的量如：实时荧光定量PCR对阈值的设定，标准曲线中斜率、截距和相关系数的允许变化范围在其数据处理和结果报告的标准操作程序中做出明确规定“灰区”的标准化程序规定（平均值±1CV）四、检测结果分析的标准化2025年4月12日分子生物学检验诊断技术的标准化标准物质是临床分子生物学检验诊断标准化的核心标准物质：均由国际标准化组织和机构提供英国国家生物学标准和质控物研究所（NIBSC）美国疾病预防控制中心（CDC）美国病理学家协会（CAP）国立卫生研究所（NIH）中国生物制品药品检定所卫生部临床检验中心质控品（含量已知、处于与实际标本相同的基质中、特性明确）根据其用途可分为室内质控品室间质评样本质控血清五、标准物质和质控物的应用2025年4月12日试剂方法的标准化

工作程序的标准化标准物质具有可比性的可靠的结果六、临床实验室分子生物学检验诊断技术标准化诸要素间的关系分子生物学检验诊断技术的标准化2025年4月12日标准物质的应用标准物质的功能试剂生产厂家在制备试剂盒时，使用标准物质来保证其试剂检测结果的溯源性临床实验室工作人员在实际工作中，使用标准物质来验证试剂方法、工作程序的实际有效性保证日常检验结果准确性的必由之路不同实验室间结果走向有条件互认的前提2025年4月12日分子生物学检验诊断技术广泛应用于临床的前提：分子生物学检验诊断技术的标准化建立分子生物学检验诊断技术的标准化操作程序建立分子生物学检验诊断技术的标准化实验室测定方法的标准化建立分子生物学检验诊断项目室内质控和室间评价系统2025年4月12日1.建立分子诊断的标准化操作程序对涉及可能会影响测定结果的每一步骤，写出标准化操作程序（standard

operationprocedure，SOP）检测或校准计划管理性程序技术性程序项目操作程序记录表格等2025年4月12日2.

建立分子诊断的标准化实验室制定：测序诊断质量保证（Diagnostic

SequencingQuality

Assurance，DSQA）DHPLC诊断质量保证（Diagnostic

DHPLCQuality

Assurance，DDQA）蛋白质组学诊断质量保证（DiagnosticProteomics

Quality

Assurance，DPQA）生物芯片诊断质量保证（Diagnostic

BiochipQuality

Assurance，DBQA）建立临床分子诊断标准化的示范实验室（demo

laboratory）2025年4月12日临床基因扩增检验实验室2025年4月12日3.测定方法的标准化一个测定方法的组成：核酸提取方法；对抑制物去除的有效性；简便性扩增及产物分析方法；扩增检测条件（循环条件、试剂等）的标准化实时荧光PCRPCR-ELISA

等如果靶核酸是RNA，还有反转录过程反转录试剂反转录效率2025年4月12日4.建立分子生物学检验诊断项目室内质控和室间评价系统室内质量控制（IQC）和室间质量评价（EQA）对于确保临床分子诊断结果的准确性非常重要，但并不容易开展主要面临的问题没有标准物质自制（分子克隆）没有参考方法对于突变检测