遗传病的诊断 课件

第十二章遗传病的诊断产前诊断1、甲胎蛋白AFP2、游离绒毛膜促性腺激素Free-HCGβ3、妊娠相关血浆蛋白PAPP-A2医学遗传学六、基因诊断

(一)概念

基因诊断是指以DNA或者RNA为诊断材料，应用分子生物学技术，通过检查基因结构及其表达功能来诊断疾病的方法。3医学遗传学（二）特点和优点

1.以探测基因为目标，属于“病因诊断”，针对性强。基因诊断的出现使人们对疾病的诊断模式由传统的表型诊断过渡为现在的基因型诊断或称逆向诊断。它和传统的表型诊断方法的主要差异在于直接从基因型推断表现型，即越过基因产物直接检测基因结构的改变（如单个碱基置换、缺失、插入、DNA的多态现象和遗传病的遗传异质性等）。

4医学遗传学

2.基因诊断取材来源广泛。可以是机体各种组织的有核细胞，因此基因诊断不受取材细胞类型和个体发育阶段的限制，可以做出现症病人的诊断及产前、发病前的早期诊断。

3.利用基因探针进行检测，灵敏度高、特异性强。5医学遗传学

4.基因探针可以是任何来源、任何种类；其检测目标可以是一个特定基因或一种特定基因组合；可以是内源基因或外源基因。因此，基因探针适用性强，诊断范围广。

5.被检测的基因是否处于活化状态对基因诊断并不重要，因此可对那些有组织和分化阶段表达特异性的基因及其异常进行检测和诊断。

6医学遗传学

此外，随着分子生物学技术的飞速发展，从基因水平上诊断遗传病的病种越来越多，操作上日趋简单、方便、快速、准确。所以基因诊断是诊断遗传病最有前途的方法。7医学遗传学原理用已知的核苷酸序列测定未知的核苷酸序列。主要包括分子杂交、DNA体外扩增（PCR）、DNA单链构象多态分析法等，其中最基本的技术是核酸分子杂交技术。8医学遗传学基因诊断的工具探针限制性内切酶9医学遗传学基因诊断1、特异性寡核苷酸探针杂交2、Southern印迹杂交3、RFLP连锁分析4、PCR10医学遗传学1、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交原理：碱基互补配对原则镰形细胞贫血的基因诊断已知突变基因编码β珠蛋白链的第6位密码子

GAG——GTG

谷Aa——缬Aa11医学遗传学2.Southern印记杂交原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。12医学遗传学

SouthernBlot操作步骤：DNA琼脂糖电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或显色13医学遗传学镰形红细胞贫血症的分子诊断1.35Kb1.15KbＣＣＴＧＴＧＧＡＧ脯缬谷ＣＣＴＧＡＧＧＡＧ脯谷谷第１１号染色体ββＳMstII识别顺序ββＳMstIIMstIICCTNAGG14医学遗传学1.35Kb1.15Kb凝胶电泳图HbAHbAHbAHbSHbSHbS15医学遗传学3、RFLP连锁分析DNA多态性：SNP、STRRFLP：不同个体的DNA用用一种限制性内切酶切割时，DNA片段长度会出现差异。16医学遗传学已知限制酶MstII

识别序列MstII1.15kb

CCTGAGG1.35kbx

probeCCTGTGG突变后不能识别，酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。17医学遗传学限制酶切片段电泳后，SouthernBlot检测，结果：

1.35kb1.15kb

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常镰状镰状贫血18医学遗传学4、PCR聚合酶链反应：在体外大量扩增DNA或RNA分子的技术1983年，美国科学家穆里斯（Karl.Mullis）发明PCR技术，并于1993年获得诺贝尔化学奖具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点19医学遗传学准备PCR反应混合物将各种组分放到试管内包括四种核苷酸，DNA聚合酶以及酶反应时需要的离子，引物最后加入模板DNA，闭管20医学遗传学步骤一：变性

利用高温将DNA双链分解成两条单链21医学遗传学步骤二：复性降低温度使引物结合到互补的DNA单链模板上22医学遗传学步骤三：延伸温度升到DNA聚合酶最佳活性温度，合成新的互补DNA链23医学遗传学多次循环多次循环就可以大量复制模板DNA

24医学遗传学最后得到巨量产物经过几十次的温度循环，就能得到天文数字般多的复制产物25医学遗传学三、分子诊断技术的应用基因诊断在遗传病中的应用例如：镰状细胞贫血的基因诊断酶解正常人DNA和患者DNA，用标记的

珠蛋白基因为探针作Southern杂交26医学遗传学镰状细胞贫血的基因诊断限制性内切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.1kb

珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于A

T破坏了MstⅡ的位点，便形成1.3kb

珠蛋白的DNA片段。27医学遗传学例如：血友病A的基因诊断PCR技术与RFLP相结合的方法。首先用PCR技术将包含突变DNA的片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来酶解，电泳后直接检测多态性位点的状态。28医学遗传学基因诊断在肿瘤中的应用ras基因突变的检测

ras基因突变的检测可采用PCR-ASO方法进行，已知ras基因突变的热点在12、13及61密码子。

p53基因的检测目前常用PCR法进行检测p53突变的热点是外显子5-8，一般可先选用外显子5-8的引物进行扩增，其后再进行突变位点的详尽