-畜禽肉中食源性兴奋剂和孕激素的测定 液相色谱-串联质谱法

ICS67.120

CCSX04

T/BPMA

北京预防医学会团体标准

T/BPMAXXXX—XXXX

畜禽肉中食源性兴奋剂和孕激素的测定

液相色谱-串联质谱法

Determinationoffood⁃bornestimulantdrugsandprogestinsinmeat

usingultra-performliquidchromatographytandemmassspectrometry

(征求意见稿）

XXXX年XX月XX日发布XXXX年XX月XX日实施

北京预防医学会发布

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出

的规则起草。

本文件由北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京市理化分析测试中心）提出并归口。

本文件起草单位：北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京市理化分析测试中心），北京

市疾病预防控制中心，北京市延庆区疾病预防控制中心。

本文件主要起草人：冯月超，刘艳，王建凤，郭巧珍，姚凯，张晶、林强、李晶晶、苏东霞。

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畜禽肉中食源性兴奋剂多残留检测液相色谱-串联质谱法

1范围

本文件规定了畜禽肉中40种食源性兴奋剂和5种孕激素含量测定的液质联用检测方法。

本文件适用于鸡肉等畜禽肉中40种食源性兴奋剂和5种孕激素含量的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过本文的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中凡是注日期的引

用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改

单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义

4方法原理

样品中的被测物经0.5%乙酸乙腈溶液震荡提取，加入氯化钠和无水硫酸镁脱水离心。上清液采

用PSA、C18、中性氧化铝和无水硫酸镁净化。采用高效液相色谱串联质谱测定，内标法定量。

5试剂和材料

除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水

5.1试剂

5.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。

5.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。

5.1.3无水硫酸镁（MgSO4）：分析纯。

5.1.4无水氯化钠（NaCl）：分析纯。

5.1.5冰乙酸（CH3COOH）：优级纯。

5.1.6甲酸（HCOOH）：优级纯。

5.1.7乙酸铵（CH3COONH4）：优级纯。

5.1.8中性氧化铝（Al(OH)3）：100~200目，层析用。

5.1.9N-丙基乙二胺键合固相吸附材料（PSA）：40μm~60μm。

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5.1.10十八烷基键合硅胶吸附材料（C18）：40μm~60μm。

5.2溶液配制

5.2.10.5%乙酸乙腈溶液：取5mL冰乙酸加入乙腈，并用乙腈定容于1000mL，混匀即可

5.2.20.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液：称取0.385g乙酸铵用水溶解，加入1.0mL甲酸，用水

定容至1000mL。

5.2.3复溶液：取0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液（5.2.2）90mL，加入10mL甲醇混匀。

5.3标准品

45种被测化合物（纯度≥98%）和9种内标物的的中英文名称和CAS号信息见附录A。

5.4标准溶液的制备

5.4.1标准储备液：准确称取附录A中的标准品适量（相当于各活性成分10mg），精密称定，分

别用甲醇适量使溶解并定容于10mL，配置成浓度为1.0mg/mL的标准储备液。在18℃以下避光储

存。−

5.4.2混合标准储备液：按照附录B依据化合物的类别将被测物分成7组，用甲醇配置成7个混合

标准储备液。所有标准溶液均在18℃以下避光储存。

5.4.3内标混合标准中间液：取组−7内标混合标准储备液适量，用甲醇配置成100ng/mL~400ng/mL

的内标混合中间液，见附录B。

5.4.4外标混合标准中间液：临用前分别取上述1-6组混合储备液1mL，用甲醇定容于10mL容量瓶，

配置成外标混合中间液，浓度范围时100ng/mL~400ng/mL，见附录B。

5.4.5系列标准工作液：移取一定量外标混合中间液用基质空白提取液逐级稀释，并向其中添加等

量的内标混合中间液。

5.5材料

5.5.1净化管：分别称取吸附材料PSA（5.1.9）、C18（5.1.10）、中性氧化铝（5.1.8）各165mg，

无水硫酸镁（5.1.3）900mg于10mL螺盖离心管中。

5.5.2微孔滤膜：有机系，0.22μm。

6仪器和设备

6.1超高效液相色谱-四级杆串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）；

6.2离心机；

6.3氮气吹干仪；

6.4超声波清洗器；

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6.5振荡器；

6.6分析天平：感量0.01g和0.00001g。

7试样制备和保存

7.1试样制备

肉类样品各约500g，放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成2份，分别装入清洁容器内，并

标明标记。

7.2试样保存

试样于-20℃以下条件下保存。

8测定步骤

8.1样品的处理

8.1.1提取

准确称取粉碎均质后的猪肉样品5.0g（精确至0.01g）于50mL螺盖离心管中，加入40μL混

合内标中间液（5.4.3），加入5mL水，涡旋10s后，准确加入20mL含0.5%乙酸乙腈溶液（5.2.1），

振荡提取15min，加入1.0g氯化钠和4.0g无水硫酸镁，快速混匀，继续振荡10min，8000r/min

离心5min。

8.1.2净化

移取上清液10mL于装入净化剂的净化管中（5.5.1），振荡10min，8000转/min离心5min。

准确移取上清液5mL，置于氮气吹干仪上45℃吹干，加入1.0mL复溶液（5.2.3），涡旋复溶，用

0.22μm微孔滤膜过滤，待上机测定。

8.1.3基质空白提取液的制备

称取不含被测物的阴性肉样品5.0g（精确至0.01g），不加内标，按照8.1.1和8.1.2的方法进

行前处理，得到空白基质提取液，用于配制标准工作曲线。

8.2空白试验

不称取试样，按7.1.2和7.1.3的步骤做空白实验。

8.3仪器分析条件

8.3.1液相色谱条件

a)色谱柱：WatersAcquityBEHC18反相液相色谱柱（2.1mm×10mm,1.7μm）或同等柱；

b)柱温：30℃；

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c)进样量：5μL；

d)流动相：A为0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水溶液（5.2.2），B为甲醇（5.1.1）。梯度洗脱

条件见表1。

表1HPLC梯度洗脱条件

时间（min）流速（mL/min）A（%）B（%）

00.3955

0.50.3955

1.00.39010

6.00.33070

8.00.32080

9.00.30100

10.00.30100

10.10.3955

12.00.3955

8.3.2质谱条件

a)电离源：电喷雾正离子模式（ESI+）；

b)检测方式：多重反应监测（MRM）；

c)毛细管电压：0.5kV；

d)锥孔电压：30V；

e)脱溶剂气流速度：650L/h；

f)脱溶剂气温度：450℃；

g)锥孔气流速：150L/h。

h)45种目标化合物及9种内标物色谱峰的保留时间及质谱参数见附录C，标准溶液特征离子

质量色谱图见附录D。

8.4定性判定

用液相色谱-串联质谱法对试样进行定性判定，在相同试验条件下，样液谱图中应呈现定量离子

对和定性离子对的色谱峰，被测物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的色谱峰保留时

间偏差在±2.5%之内；试样色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度与相当浓度标准溶液的离子相

对丰度比的偏差不超过表2规定范围，则可以判断试样中存在对应的目标物质。

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表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度/%>5020~50（含）10~20（含）≤10

允许的相对偏差/%±20±25±30±50

8.5定量测定

在高效液相色谱-串联质谱联用分析条件下，将5μL系列标准工作溶液（5.4.5）按浓度从低到

高的顺序依次注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，记录峰面积、保留时间等信息。

以基质标准工作溶液中目标物峰面积与对应内标峰面积比为纵坐标，目标物浓度为横坐标绘制

标准工作曲线，用标准工作曲线对样品溶液进行定量，计算试样目标物的上机浓度。标准工作溶液

和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内，如果样液含量超过标准曲线范围，则应重新

取样测定。

9结果计算和表述

试样中各被测物含量按照式（1）计算：

X=………………（1）

式中:

X——样品中待测组分的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

c——从标准曲线计算得到的目标化合物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V——浓缩至干后试样的定容体积，单位为毫升（mL）；

m——样品的称样量，单位为克（g）；

4——前处理过程引入的稀释因子。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留一位小数。

10方法准确度、精密度和灵敏度

10.1准确度

本方法的回收率范围是60%~120%。

10.2精密度

本方法的批内相对标准偏差≤20%,批间相对标准偏差≤20%。

10.3灵敏度

当称样量为5.0g时，本方法的定量限见附录D。

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附录A

（资料性）

目标化合物及内标物中英文名称和CAS号

表A.1为目标化合物及内标物中英文名称和CAS号。

表A.1目标化合物及内标物中英文名称和CAS号

序号中文通用名称英文通用名称CAS号分子式

1克伦特罗clenbuterol37148-27-9C12H18Cl2N2O

2妥布特罗tulobuterol41570-61-0C12H18ClNO

3班布特罗bambuterol81732-65-2C18H29N3O5

4克伦丙罗clenproperol38339-11-6C11H16Cl2N2O

5喷布特罗penbuterol36507-48-9C18H29NO2

6克伦塞罗clencyclohexerol157877-79-7C14H20Cl2N2O

7马布特罗mabuterol56341-08-3C13H18ClF3N2O

8溴布特罗brombuterol41937-02-4C12H18Br2N2O

9西马特罗cimaterol54239-37-1C12H17N3O

10氯丙那林clorprenaline3811-25-4C11H16ClNO

11奥西那林metaproterenol586-06-1C11H17NO3

12沙丁胺醇salbutamol18559-94-9C13H21NO3

13齐帕特罗zilpaterol117827-79-9C14H19N3O2

14莱克多巴胺ractopamine97825-25-7C18H23NO3

15沙美特罗salmeterol89365-50-4C25H37NO4

16阿替洛尔atenolol29122-68-7C14H22N2O3

17普萘洛尔propranolol525-66-6C16H21NO2

18美托洛尔metoprolol37350-58-6C15H25NO3

19氨苯喋啶triamterene396-01-0C12H11N7

20螺内酯spironolactone52-01-7C24H32O4S

21坎利酮canrenone976-71-6C22H28O3

22睾酮testosterone58-22-0C19H28O2

23诺龙nortestosterone434-22-0C18H26O2

24去氢甲睾酮methandienone72-63-9C20H28O2

25勃地酮boldenone846-48-0C19H26O2

26群勃龙trenbolone10161-33-8C18H22O2

27雄烯二酮4-androstene-363-05-8C19H26O2

28脱氢表雄酮prasterone53-43-0C19H28O2

29甲基睾酮methyltestosterone58-18-4C20H30O2

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表A.1目标化合物及内标物中英文名称和CAS号（续）

序号中文通用名称英文通用名称CAS号分子式

30美睾酮mesterolone1424-00-6C20H32O2

31美雄诺龙mestanolone521-11-9C20H32O2

32司坦唑醇stanozolol10418-03-8C21H32N2O

33地塞米松dexamethasone50-02-2C22H29FO5

34氢化可的松hydrocortisone50-23-7C21H30O5

35波尼松龙prednisolone50-24-8C21H28O5

36可的松cortisone53-06-5C21H28O5

37波尼松prednisone53-03-2C21H26O5

38醋酸氟轻松fluocinoloneacetonide67-73-2C24H30F2O6

39氟氢可的松fludrocortisone127-31-1C21H29FO5

40倍氯米松beclomethasone4419-39-0C22H29ClO5

41孕酮progesterone57-83-0C21H30O2

42醋酸美伦孕酮melengestrolacetate2919-66-6C25H32O4

43醋酸甲羟孕酮medroxyprogesteroneacetate71-58-9C24H34O4

4417α-羟孕酮17α-Hydroxyprogesterone68-96-2C21H30O3

45甲地孕酮megestrol3562-63-8C22H30O3

I-1克伦特罗-D9clenbuterol-D9129138-58-5C12H9D9Cl2N2O

I-2莱克多巴胺-D5ractopamine-D590274-24-1C18H18D5NO3

I-3沙丁胺醇-D3salbutamol-D31219798-60-3C13H19D3NO3

I-4甲基睾酮-D3methyltestosterone-D396425-03-5C20H27D3O2

I-5睾酮-D3testosterone-D377546-39-5C19H25D3O2

I-6勃地酮-D3boldenone-D3361432-76-0C19H23D3O2

I-7孕酮-D9progesterone-D915775-74-3C21H21D9O2

I-8氢化可的松-D3hydrocortisone-D3115699-92-8C21H27D3O5

I-9地塞米松-D5dexamethasone-D5358731-91-6C22H24D5FO5

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附录B

（资料性）

混合标准储备液和混合中间液分组、配制浓度

本方法目标化合物和内标物混合标准储备液、混合中间液分组、配制浓度见表B.1。

表B.1混合标准储备液和混合中间液分组、配制浓度

储备液浓度中间液浓度

序号被测化合物组别对应的内标物

（μg/mL）（ng/mL）

1克伦特罗1100组1

2妥布特罗1100组1

3班布特罗1100组1

4克伦丙罗2200组1

5喷布特罗1100组1

6克伦塞罗1100组1克伦特罗-D9

7马布特罗2200组1

8溴布特罗1100组1

9西马特罗2200组1

10氯丙那林1100组1

11奥西那林1100组1

12沙丁胺醇1100组1

沙丁胺醇-D3

13齐帕特罗1100组1

14莱克多巴胺1100组1

莱克多巴胺-D5

15沙美特罗1100组1

16阿替洛尔1100组2

17普萘洛尔1100组2克伦特罗-D9

18美托洛尔1100组2

19氨苯喋啶2200组3莱克多巴胺-D5

20螺内酯2200组3勃地酮-D3

21坎利酮2200组3

22睾酮2200组4

睾酮-D3

23诺龙2200组4

24去氢甲睾酮2200组4

25勃地酮2200组4

26群勃龙2200组4勃地酮-D3

27雄烯二酮2200组4

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表B.1混合标准储备液和混合中间液分组、配制浓度（续）

储备液浓度中间液浓度

序号被测化合物组别对应的内标物

（μg/mL）（ng/mL）

28脱氢表雄酮2200组4

29甲基睾酮2200组4甲基睾酮-D3

30美睾酮8200组4

31美雄诺龙2200组4孕酮-D9

32司坦唑醇2200组4地塞米松-D5

33地塞米松4400组3

34氢化可的松4400组5

35波尼松龙4400组5

36可的松4400组5氢化可的松-D3

37波尼松4400组5

38醋酸氟轻松4400组5

39氟氢可的松4400组5

40倍氯米松4400组5

41孕酮2200组6孕酮-D9

42醋酸美伦孕酮2200组6

43醋酸甲羟孕酮2200组6睾酮-D3

4417α-羟孕酮2200组6

甲基睾酮-D3

45甲地孕酮2200组6

I-1克伦特罗-D91100组7/

I-2莱克多巴胺-D51100组7/

I-3沙丁胺醇-D31100组7/

I-4甲基睾酮-D32200组7/

I-5睾酮-D32200组7/

I-6勃地酮-D32200组7/

I-7孕酮-D92200组7/

I-8氢化可的松-D34400组7/

I-9地塞米松-D54400组7/

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附录C

（资料性）

目标化合物及内标物的保留时间及主要质谱参数

本方法目标化合物及内标物的保留时间及主要质谱参数见表C.1。

表C.1目标化合物及内标物的保留时间及主要质谱参数

保留时间母离子子离子碰撞能碎裂电压

序号目标化合物

(min)(m/z)（m/z）(V)(V)

132.1*26

1克伦特罗4.56277.434

203.114

172.2*10

2妥布特罗4.97228.418

154.116

72.2*34

3班布特罗5.12368.718

294.420

203.1*16

4克伦丙罗2.83263.326

168.126

236.3*14

5喷布特罗7.31292.572

74.220

203.1*20

6克伦塞罗3.81319.436

81.126

217.2*24

7马布特罗5.02311.420

237.214

132.3*46

8溴布特罗4.96367.426

293.118

160.2*14

9西马特罗2.64220.418

143.224

154.2*16

10氯丙那林4.51214.318

118.926

152.1*16

11奥西那林2.20212.322

125.220

148.2*16

12沙丁胺醇2.86240.416

166.212

185.2*24

13齐帕特罗2.82262.418

202.218

107.2*26

14莱克多巴胺4.21302.526

164.214

91.2*38

15沙美特罗7.31416.725

380.618

145.2*26

16阿替洛尔2.87267.420

74.222

183.2*18

17普萘洛尔5.94260.418

116.216

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表C.1目标化合物及内标物的保留时间及主要质谱参数（续）

保留时间母离子子离子碰撞能碎裂电压

序号目标化合物

(min)(m/z)（m/z）(V)(V)

72.1*18

18美托洛尔4.75268.518

116.218

141.1*44

19氨苯喋啶4.43254.416

104.238

107.2*26

20螺内酯7.10341.548

91.148

107.2*28

21坎利酮7.11341.558

91.152

97.1*20

22睾酮7.49289.548

109.222

109.2*28

23诺龙7.20275.52

239.316

121.1*26

24去氢甲睾酮7.31301.526

149.214

121.1*26

25勃地酮7.06287.530

135.214

199.2*22

26群勃龙6.98271.462

165.344

97.2*20

27雄烯二酮7.19287.534

109.224

253.3*10

28脱氢表雄酮7.49289.56

213.318

97.1*26

29甲基睾酮7.75303.632

109.224

269.4*16

30美睾酮8.33305.515

95.632

269.4*14

31美雄诺龙8.45305.610

105.220

81.1*38

32司坦唑醇8.33329.616

95.138

373.4*8

33地塞米松6.78393.512

355.310

121.1*22

34氢化可的松6.42363.544

105.144

325.4*8

35波尼松龙6.42361.524

307.410

163.2*24

36可的松6.19361.618

121.236

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表C.1目标化合物及内标物的保留时间及主要质谱参数（续）

保留时间母离子子离子碰撞能碎裂电压

序号目标化合物

(min)(m/z)（m/z）(V)(V)

147.1*26

37波尼松6.11359.528

313.412

121.2*28

38醋酸氟轻松6.82453.516

433.48

239.3*24

39氟氢可的松6.34381.538

91.258

373.4*8

40倍氯米松6.81409.56

121.242

97.1*20

41孕酮8.40315.512

109.222

279.2*22

42醋酸美伦孕酮8.30397.2