《家禽细胞免疫评估方法的操作规范》团体标准征求意见稿

1家禽细胞免疫应答评估方法的操作规范本文件适用于病原微生物抗原刺激下家禽的细胞免疫应答评GB/T6682分析实验室用水规GB/T24863-2010畜禽细胞体外培养与冷冻保存一种来源于胸腺的淋巴细胞，在细胞免疫中发挥核心作用，分为CD4+T细胞、CD8+T细胞、又称辅助性T细胞，表面带有CD3和CD4受体，通过释放多种细胞因子调又称细胞毒性T细胞，表面带有CD3和CD8受体，主要通过识别和杀伤病原体感染细胞，发挥免疫24缩略语AIV：禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus）APC：抗原递呈细胞（Antigen-presentingCells）CXCLi2：CXC基序趋化因子配体2（CGranzymeA：颗粒酶A（GraGranzymeK：颗粒酶K（GranIL-1β：白细胞介素-1β（Interleukin-1BIL-2：白细胞介素-2（InterleukIL-4：白细胞介素-4（InterleukIL-5：白细胞介素-5（InterleukIL-6：白细胞介素-6（InterleukIFIT5：干扰素诱导蛋白5（Interferon-induceproteinwithtetratricIFN-α：干扰素-α（Interferon-AlphIFN-β：干扰素-β（Interferon-BIFN-γ：干扰素-γ（Interferon-GaMDA5：黑色素瘤分化相关基因5（Melanomadifferentiation-aMOI：感染复数（MultiplicityofInfection）NKlysin：自然杀伤细胞溶素基因（NKlysin）OASL：2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶样蛋白（2'-5'-OliPARP：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly(ADP-Ribose)PolymeraPBMCs：外周血单个核细胞（PeripheralBloodMPerforin：穿孔素（PerforiTCID50：半数组织培养感染剂量（50%TissueCultuTNF-α：肿瘤坏死因子-α（TumorNecrosisFactorTGF-β3：转化生长因子-β3（TransformingGroTLR-3：Toll样受体3（Toll-likeRecepto3TLR-7：Toll样受体7（Toll-likeRecepto5外周血单个核细胞及脾脏单个核细胞分离技术5.1仪器与设备5.2试剂与耗材5.2.1鸡外周血单个核细胞分离试剂盒/鸡脏器组织单个核细胞分离试剂盒。5.3试验方法5.3.1.1样品稀释5.3.1.2密度梯度离心5.3.1.3细胞收集与洗涤换PBS后重悬）。若出现红细胞污染，可利用0.5mL5.3.1.4细胞重悬用1mLRP10培养基重悬细胞，计数后调整至1×106个/mL，放置于冰上待用。5.3.2.1脾脏收集5.3.2.2组织处理将脾脏剪成小块，加入5mLRP10培养基。使用巴氏吸管轻轻吹打45.3.2.3密度梯度离心5.3.2.4细胞收集与洗涤吸取中间白色细胞层至新离心管中。加入PBS洗涤），若出现红细胞污染，可利用0.5mL红细胞裂解液重悬细胞3min，然后加入PBS额外洗涤一步进行去除。5.3.2.5细胞重悬5.3.2.6分层效果评估5.4结果判定5.4.1.1计数方法释后的细胞悬液与10μL染液1:1混合，5.4.1.2细胞分离质量判定存活率需保持在90%以上，且每个样品的细胞6.2.1MouseAnti-ChickenCD3-APC6.2.2MouseAnti-ChickenCD4-FITC6.2.3MouseAnti-Ch5从家禽外周血（每组应不少于6只鸡/鸭的个体重复）或脾脏（每组应不少于3只鸡/鸭的个体重复）分离PBMCs或脾脏单个核细胞，并使用淋巴Buffer洗涤2次后调整细胞浓度至不少于1×106个细胞/mL，流式细胞仪收集细胞的数量应不少于3×105，以保证信号的可靠性。每管加入1×106个PBMCs或脾脏单个核细胞于流式细胞仪专用检测管中，使用下列抗体孵育：APC用流式Buffer洗涤3次：每次加入流式Buffer将洗涤后的细胞重悬于500μL流式Buffer。使用流式细胞仪进6.4.1数据处理：数据以百分比表示，统计样本中CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+T细胞及6.4.2实验对照：设置未标记样本（阴6.4.3实验效果评估：与无抗原刺激组（对照组）相比，抗原刺激组（或处理组）CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+T细胞及CD3+CD4+CD8+细胞的比例有显著差异（P＜0.05或0.01或0.001），若67.2.1MouseAnti-ChickenCD3-AP7.2.2MouseAnti-ChickenCD4-FI7.2.5羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxyfluoresceinsuccinimidylester，CFSE）。取6×105细胞/孔于15mL生化管中，病毒常规感染细胞后，继续孵育7.3.2.2.1将从病原感染或免疫的家禽中分离记忆性PBMC7.3.2.2.2按以下分组设计实验，每7.3.2.3.1每天使用倒置显微镜观察细胞的7.3.2.3.2每日取细胞悬液，用0.08离心管用5mL预热的PBS重悬1×107个细胞，另取一个15mL离心管用5mLPBS稀释CFSE，将两管混合7T细胞和CD3+CD4+CD8+T细胞比例和绝对数量的变化。7.4.1形态学变化：利用显微镜观察刺激后细胞的形态学变化，病毒刺激组和7.4.2CFSE标记检测：病毒刺激组和ConA刺激组的细胞会出现多个增殖峰，7.4.3流式细胞术检测T细胞比例及绝对数量的变化：与未刺激激组的T细胞比例和绝对数量会显著增加，如附录A8.2.1鸡IFN-γELISpotB8.3.2孔板封闭：用RP-10在室8PMA+Ionomycin（10μg/mL）。实验组：病毒或抗min，避免过度显色导致背景增加。反应完成后8.3.5.1斑点计数：使用酶联免疫斑点分析仪计数斑点数量，记录各孔数据。8.4.1斑点计数：使用酶联免疫斑点计数仪2个生物学样本中诱导了显著的IFN-γ产生，则说明抗原可以刺激细胞毒性9.1仪器和设备9.1.1细胞培养箱。9.1.2离心机。9.1.3移液器。9.1.4流式细胞仪。9.2试剂与耗材9.2.1MouseAnti-Chicken9.2.2RabbitAnti-Chi9.2.3MouseAnti-Chick9.2.4GoatAnti-Rabbit9.2.6离心管。9.3试验方法9.3.1细胞培养9.3.2抗原再刺激及封闭9按照章节7中的方法进行APC的孵育，按用每孔100μLT细胞培养基重悬APC后加入到培养的细胞中，同时按照1：1000的比例加入BFA共孵育6h。9.3.3表面标志物染色取细胞用流式Buffer洗涤3次：每次加入PBS至1mL，轻轻混匀后以400g/min离心5min。弃上清后用T细胞表面标记抗体（如TCRγδ,CD8用流式Buffer清洗细胞3次后，按照1×106个细胞/100μL细胞固定破膜剂重悬细胞，4℃避光孵育209.3.5胞内标志物染色孵育30min，轻轻混匀避免细胞沉淀。离心后用山9.3.6数据分析9.4结果判定9.4.2实验对照：设置未标记样本（阴性对照）和单通道抗体染色标记样本（用于补偿计算）。9.4.3结果分析：按照上述方法进行检测，阳性样本会出现明显的分群，与未刺激组相比，刺激组中产生IFN-γ的T细胞百分比显著上调（P＜0.05或0.01或0.0），根据RNA逆转录试剂盒产品说明书进行，使用PCR扩增仪实时荧光定量PCR仪自动记录Ct值，采用2-ΔΔCt方法计算相对表达量：相对表达量=2−ΔΔCt使用GraphPadPrism绘制基因表达差异数据用平均值(±)标准误表示，使用单因素方差分析（ANOVA用于比较3个或3个以上处理组之间的差异）或t检验进行组间（用于比较两个处理组之间调（P＜0.05或0.01或0.001），表明刺激了细胞毒性T细胞免疫应答反应；若是Th2细胞因子上调），10.4.4.2熔解曲线：检查特异在培养第4天，使用无菌管收集细胞培养上清，400g/min离11.3.4.1试剂准备：使用前充分混匀试剂，避免产生气11.3.4.5酶结合反应：每孔加入80μL链酶亲和素-HRP溶液，轻轻混匀后37℃温育30min。采用GraphPadPrism软件绘制柱状图，展示不同实验组间的基因或蛋白表达之间的差异）或t检验进行组间（用于比较两个处理组之间通过样品的基因或蛋白表达水平判断免疫反应状态。与未刺激组种或多种实验技术监测家禽T细胞产生效应因子，均可说明家禽T细胞在抗原刺激后产生效应应答。若要监测特定T细胞亚类产生效应应答，则只能通过IFN-γICS方法检测，或流式分选NM_204305.1NM_001024836.1NM_