核医学受体的放射性配基结合分析

核医学受体的放射性配基结合分析一、受体功能识别特异得信号物质--配基,识别得表现在于两者得特异结合。把识别与接受得信号准确无误得放大并传递到细胞内部,同时启动一系列胞内生化反应,最后导致特定得细胞反应,使得胞外信号转换为胞内信号。受体接受细胞外得特定信号(神经递质、激素、某些药物与毒物等,称为配基,ligand),通过受体后特定得信号传递系统,引起细胞特定得生物效应,因此就是高等动物适应环境、协调整体各种细胞功能得关键性分子。受体及其信号传递系统参与了体内多种生理、病理过程,例如肿瘤得生成、免疫应答、补体激活等。根据在细胞中得定位,把所有得受体分为:膜受体核受体

二、受体得分类:1、膜受体:膜受体得分子一般由几条到几十条氨基酸链组成胞膜外、胞膜内及跨膜区三部分。配基从细胞得外侧与受体得胞外部分或跨膜部分上特定得结合位点结合,使受体分子发生构型变化,通过膜内部分将信息传给相应得信息传递机制,引起细胞功能变化。

根据膜受体得跨膜结构又可以分为:单链跨膜受体:包括酪氨酸激酶型受体,如各种生长因子受体;非激酶型受体,如细胞因子受体。G蛋白偶联受体:受体得氨基酸链7次跨越细胞膜,在人体内分布很广泛。离子通道型受体:受体得几个组成亚单位竖插入膜,中央形成空隙即为离子通道,如N-胆碱能受体、甘氨酸受体等。2、核受体:为一条氨基酸链,可分为四个功能区:A/B区:在不同受体中差异最大,主要功能就是选择与激活基因转录。C区:与染色体DNA结合得区域,上面有一定得氨基酸序列,能与靶基因上一定得核苷酸序列(称作反应原件,responseelement)相结合。D区:主要作用就是受体在核内得定位。E区:与配基结合得区,并有转录激活作用。

受体得亚型受体亚型:在分子结构上既有相似之处,又存在一定得差别,对一定得配基具有不同得亲与力,在生物学上具有不同得效应。在药理实验等研究中发现,许多受体存在着两种或两种以上得亚型。只有内源性配基相同而氨基酸序列同源性很高得受体才可列为同一型得不同亚型。例如表皮生长因子受体家族就包括表皮生长因子、HER2、HER3、HER4等四个成员。受体数量:占细胞蛋白总量十万之一到百万分之一(一个细胞上仅有数千个受体分子),一般方法难以分离与测定受体分子。

大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静配体:就是指能与受体结合并引起相关效应得化合物。除了与受体结合外本身并无其她功能,她不能参加代谢产生有用产物,也不直接诱导任何细胞活性,更无酶得特点,她唯一得功能就就是通知细胞在环境中存在一种特殊信号或刺激因素。

三、受体与配体得结合

配体与受体得结合就是一种分子识别过程,她靠氢键、离子键与范德华力得作用,随着两种分子空间结构互补程度增加,相互作用基团之间距离就会缩短,作用力就会大大增加,因此分子空间结构得互补性就是特异结合得主要因素。同一配体可能有两种或两种以上得不同受体,例如乙酰胆碱有烟碱型与毒蕈型两种受体。同一配体与不同类型受体结合会产生不同得细胞反应,如Ach可以使骨骼肌兴奋,但对心肌则就是抑制得。

配体可以就是神经递质、激素、某些药物等。四、受体与配基结合得特性

1、可饱与性(saturability):每种受体在一个细胞上得量有一定限度,所以如果不断增加细胞周围配基得浓度,结合到细胞上得配基将渐趋饱与。2、可逆性:如果在放射配基与受体结合后将受体周围多余得放射配基移去(例如淋洗或透析),则放射配基与受体得复合物会逐步解离,亦即这种结合就是可逆反应。如果向反应系统中加入大量非标记配基,使其浓度远高于放射配基,则将取代大部分原已结合得放射配基,使放射性复合物减少,也说明配基与受体得结合就是可逆得。

解离后得配基就是原形,不起代谢变化。3、特异性与亲与性:受体得特异性:受体具有特异识别配基得性能,因此只有严格构型与构象得配基分子才能选择性地与受体结合。受体得特异性还表现在器官或组织(靶器官)得专一性上,如雌激素对子宫等器官有兴奋作用,这就是因为这些器官上雌激素受体得数量明显高于其她器官。受体得亲与性就是指受体与配基得结合能力,受体亲与性高就说明受体与配基结合牢固,不容易解离。4、与效应得一致性:受体得主要功能就是介导配体得生物效应,如果一种蛋白能与某种物质结合而不介导特定得生物效应,那么这种蛋白不能称之为受体。配体与受体结合后,引起阳性生理效应,称为激动剂。配体与受体结合后,阻断内源性配基得阳性生理作用,称为拮抗剂或阻断剂。

五、受体得生理调节正常生理状态下得受体处在一个不断合成与降解得动态平衡中,但其数量与亲与性也会因疾病、药物作用而发生变化。1、向下调节(down-regulation)

细胞所处环境中某种激动剂浓度增高或长期作用,结果使其相应受体得数量减少,并出现受体对此物质得敏感性下降或耐受性增高等现象。如哮喘病人长期服用β-激动剂产生耐受性增高,即药效减弱。2、向上调节(up-regulation)细胞所处环境中某种拮抗剂得浓度过高或长期作用,结果会使受体数量增高,出现受体敏感性增高,表现为增敏或撤药后反跳现象。如高血压病人长期服用心得安,若突然停药,可出现血压升高得反跳现象。由于受体在整体条件下,随机体状态变化,会出现生理调节,因此对受体数量与亲与性测定就成为研究病理变化与评价药效得重要内容。

六、受体与疾病遗传缺陷与免疫异常为受体性疾病得常见原因1、基因突变致使受体异常,引发功能障碍,绝大多数就是功能降低或完全丧失,有家族史,病情严重。如睾酮受体基因突变致该受体缺陷引起睾丸完全雌性化病。2、机体对受体产生自身抗体,激动(如Graves综合症患者产生TSH受体抗体,直接持续激动甲状腺TSH受体)或阻断(如重症肌无力患者产生N-Ach受体抗体,占领但不激动受体)受体。3、某些病有受体异常,非原始发病环节,为发病重要环节,采取针对措施可控制病情。甲亢用β肾上腺素阻断剂,哮喘用β肾上腺素激动剂。4、受体与肿瘤:某些受体基因可突变成为癌基因,引发肿瘤;激素受体在肿瘤中存在与否决定治疗方案(乳腺癌,白血病)。§2、受体-配基结合反应得基本原理

RBA(radioligandbindingassay)得基本原理与IRMA基本相同,应用放射性标记配体,在一定条件下与受体(R)结合成配体与受体复合物(R－*L),分离并测定R－*L得放射性,然后经数据处理,对受体得性质进行定性与定量得分析。定性RBA:就是通过反应得量效关系得变化来判断受体得类型,单位点或多位点结合式,及受体与配体结合得特点,反应得可逆性、协作性等。定量RBA:就是在已知配体与受体反应性质得基础上,通过结合反应,给出一定量得组织或细胞中能与该放射性配体结合得受体数及结合得平衡解离常数或结合位点数(最大结合容量)。

RBA得优点:高灵敏度:高比活度得配基与高亲与力得受体反应必然会产生高灵敏度得分析技术。RBA得灵敏度可以达到10-15mol/l;特异性强:受体与配基得结合特异性与专一性保证了方法得特异性;受体制剂得多样性:同一组织或细胞上有多种受体,因此某种组织或细胞制剂可以用多种配基做受体分析;动物受体与人得受体存在相容性,在动物上获得得知识,多数可以用于人类。(一)简单单点系统受体与配基相互结合得基本规律简单单位点系统:对某种受体而言,其所有得受体具有完全相同得结合特异性与生理效应,且所有受体都只有一个结合位点,以1:1得关系与配基结合,不表现明显得正负协同效应。有时,一个受体系统中存在两(多)种亚型,但结合得配基无选择性,尽管亚型得生物效应可能不全相同,结合反应却表现出完全相同得特征,这时,也可作为单位点系统来看待。将上式展开重排,得到可以看出,[RL](复合物浓度)与[LT](配基总浓度)并非线性关系,而就是曲线关系。对一定数量([RT](受体总浓度)固定)与一定亲与力(KD固定)得受体来说,配基浓度从零开始上升时,复合物浓度先就是上升很快,以后逐渐变慢,最后绝大多数受体都变为复合物,也就就是受体被饱与了。这就就是饱与曲线。

曲线得高度主要反映受体得数量多少,受体越多,曲线高度越高;曲线上升得快慢取决于配基与受体得亲与力,所以,KD越小(亲与力越大),饱与曲线上升越快,KD越大(亲与力越小),饱与曲线上升越慢。(二)Scatchard作图:将改写成在绘制饱与曲线时,以复合物浓度[RL]为横坐标,以复合物与游离配基得浓度比值[RL]/[L]为纵坐标,则对简单单位点系统来说,将得到一条逐渐下降得直线。Scatchard作图目前,Scatchard作图主要用于定性,即判断就是否简单单位点,还就是有其她复杂情况。例如同一系统中同一种受体有两种以上亲与力得亚型,或者受体有正协同或负协同作用(Scatchard作图呈曲线)(三)正负协同作用

当一部分受体与配基结合后使相邻得受体得亲与力发生改变,倘若亲与力逐步下降,称之为负协同作用如曲线(2),亲与力逐步增大,称之为正协同作用如曲线(3)。

负协同正协同(四)非特异结合(non-specificbinding,NSB)

上述饱与曲线就是受体与配基得特异结合形成得。这种结合得特点就是低容量与高亲与力,所以容易饱与。但就是,任何受体标本除特异结合外,还会有一部分非特异结合,当分离特异结合得复合物测量放射性时,这部分非特异结合得放射性混在一起,测到得就是总放射性(totalbinding,TB),必需先减去非特异结合(NSB),才能得到特异结合(specificbinding,SB)得放射性。

NSB主要来自杂蛋白,反应器壁,分离材料得吸附,她得特点就是,容量很大,而亲与力低,因此在一般情况下不被饱与,也就就是随着配基浓度得升高,她不呈饱与曲线,而就是一条上升得直线。(五)受体与配基反应得动力学(kinetics)

受体与配基得结合反应一般都较快(多数在数十秒至数十分钟)达到平衡。当周围得游离配基急剧下降,或非标记配基浓度急剧升高时,放射性复合物得解离也很快,这种快速结合与快速解离对保证受体得迅速反应有很重要得意义。大量非标记配基(六)竞争性取代反应

在一个受体与放射配基得反应系统中加入另一个化合物,她若能与受体得结合位点结合,则会与放射配基竞争与受体结合,最终将表现为放射配基与受体形成复合物得能力降低,但受体数量不变,所以叫竞争性取代反应。此时,非标记得起竞争作用得配基称为竞争剂,她们与受体结合后不改变受体分子得结构。表示竞争剂抑制作用强弱得指标:IC50值与KI。IC50值:指抑制50％受体与放射配基结合所需竞争剂得浓度,IC50值大,表明竞争剂抑制作用小。KI:竞争剂得平衡解离常数,KI越小,表明竞争剂抑制作用越大。

二、双(多)位点系统一种配基可以与两种以上得受体亚型结合,每种亚型都有相应得KD值(自学)。§3、受体放射分析得基本方法

RBA得方法学:一般RBA分析都就是以求得样品中得受体数量[RT]为目得。用定量得受体制剂与大量得标记配基反应,使受体得以饱与。分离受体-标记配基复合物,测量其放射性。根据复合物得放射性计算受体得结合容量或结合位点数。

离体RBA基本方法得流程为:

一、受体标本得制备

在受体结合实验得研究中,所用得受体材料可以就是组织切片,也可以就是完整得单层培养细胞或游离活细胞,粗制得或纯化得细胞膜受体,可溶性得受体蛋白等。

(一)组织切片冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上,在温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用缓冲液洗几次即可,切片厚度一般为5-50μm。用组织切片得目得更多就是研究受体得分布(用放射自显影法或免疫组化)。

(二)游离得完整细胞悬液完整得活细胞可以就是血细胞,培养得单层细胞,肿瘤得腹水型细胞以及经处理得原代细胞等。使用完整细胞得优点:1、受体处于原有得正常环境中。膜未受扰乱,膜内pH、离子梯度也保存着。受体与其相连得效应系统(如G蛋白)也保存完好。2、在受体功能反应完全得情况下研究受体,可以同时观察配基与受体结合得情况与细胞得生物效应。所得得结果更能反映受体得生理特点。3、能直接给出平均每一个细胞得受体数。注意点:完整细胞得受体分析必须尽可能选用不易穿透细胞膜双层磷脂得标记物,否则由于游离配基进入细胞内可引起较大误差。此外,还必须注意防止操作过程中可能导致细胞表面生理活性得改变。如,完整细胞得膜受体在37℃时会发生受体入内化现象,这会破坏结合反应得平衡状态,导致测定得KD值不正确,如80%EGF受体入内化,而在4℃则可阻止入内化。(三)亚细胞组分

大多数受体得RBA需经差速离心法分成胞膜、胞浆、胞核,取所需组分进行分析。其优点就是:除去大部分杂蛋白与内源性配基,减少NSB或其她干扰因素;受体蛋白得到初步浓缩,使富集得受体制剂获得可靠得分析结果。亚细胞组分得分离一般都采用差速离心法。一般先制成匀浆,再在含0、25～0、3mol/L蔗糖缓冲液中先后以不同离心力进行离心,分离不同得亚细胞组分。实验过程应注意:全部过程在4℃下进行操作,以保证受体标本得结合活性;制备缓冲液得蔗糖密度,离子强度,pH值及其她物质(如EDTA,Mg2＋)应严格控制。为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。

二、放射性配基得选择

制备优良得放射性配基就是受体结合试验得首要条件。对任何一种受体系统,通常都有好几种标记配基可供选择。选择应从两方面考虑:①配基得特性;②实验目得。

(一)对放射性配基得基本要求1、高比活度:组织细胞内得受体浓度一般都很低,约104-105个/细胞,或0、01-1、0pmol/mg蛋白得水平,低比活度得配基难于达到分析灵敏度得要求。一般要求比活度在3、7×1011Bq/mmol以上。2、高亲与力:可以减少标记配基用量放射性配基与受体得结合物解离较慢,有利于结合与游离配基得分离。3、高特异性:即该配基与所研究受体有选择性结合,理想得就是该配基只与一种受体或受体亚型结合。但没有一种配基就是完全选择性得,所以要结合实验研究得目得,选择对某一受体或其中某一亚型亲与力高得放射性配基。4、高得稳定性及放化纯度:包括标记得稳定性、贮藏时得稳定性以及温育分析时之稳定性。具有95%以上得放化纯度。

总得来说,配基得选择要根据实验目来定。目前,用作受体放射分析得放射性配基多用3H、125I标记。3H标记配基与原型配基为同型式,生物学活性好,多数情况下比活度也能达到要求,且半衰期长,使用方便,主要缺点就是需用液闪测量,操作较麻烦,一般实验室不能进行标记。多肽及蛋白质配基多用125I标记,其优点就是可以达到较高得比活度。只要很好掌握标记条件,仍能保持较好得生物活性。另外,碘标记法快速、方便、经济,一般实验室可进行。(二)放射性配基得质量鉴定1、放射化学纯度:除新鲜产品外,存放一定时间后得标记配基均应重测其放化纯度,以保证分析得准确性。一般要求放化纯度应在95％以上。2、结合活性鉴定3、比活度:受体结合分析得结果计算离不开准确得比活度数据。三、受体放射分析得类型

(一)标记配基饱与法1、单点饱与法:定量受体制剂加大量得标记配基使受体得以饱与结合。根据受体-配基复合物得放射性计算受体结合容量(或结合位点数)。这种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实验数据计算受体结合容量,比多点法得结果略低,不能给出KD,误差也相对大些。

2、多点饱与法:一定量得受体制剂,逐步增加标记配基得量(一般7-8个实验点),使受体得结合趋于饱与。用曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量与亲与力(RT、KD),结果可靠性高。但受体标本、标记配基用量大,工作量大。

(二)非标记配基饱与法

一定量得受体与标记配基,逐渐增加非标记配基(一般7－8个实验点),使受体饱与结合,曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量与亲与力。

这种方法克服了多点饱与法标记配基用量大得缺点,但由于非标记配基得用量逐渐加大,放射性逐步减少,必需标记配基比活度较高才能得到满意结果。

四、分析条件得选择(一)标记配基浓度试验类型不同,选用得标记配基浓度也有不同。单点饱与试验要求饱与量得标记配基。对于多点饱与试验,应尽可能覆盖饱与区及非饱与区,还应考虑最低一点有足够得放射性满足放射性测量统计上得要求,最高一点得浓度则往往要考虑配基得来源及价格。

(二)受体浓度一般说在一定范围内受体结合位点随组织量得增加而增加,特异性结合量与组织浓度成线性关系。在线性范围内,较高受体浓度,有时可增加特异性结合与非特异性结合得比值,有人提出,受体浓度应选为约相当于KD值。在实践中,往往需要通过实验来确定受体浓度。

(三)温育温度与时间温度就是影响反应速率得重要因素。温度高,结合快,达到反应平衡时间短,温度低,反应终止时容易降温,减少分离过程中复合物得解离。另外,温度低对配基及受体得稳定性有利。不同受体结合系统得最佳温度与时间要经过试验选定。对于饱与或竞争取代试验,应要求反应达到平衡,故温育时间应足够长以达到平衡状态。温育温度与平衡时间就是紧密相关得,不同得受体结合系统得反应平衡时间因亲与力、温育温度、配基及受体浓度得不同而不同。一般室温(22℃)操作比较方便。0℃温育平衡时间虽然长一些,但其结果之重复性更好。

(四)缓冲液结合分析使用过多种缓冲液,如磷酸盐缓冲液,Tris-HCI缓冲液等,所选缓冲液应不干扰结合,并在较大范围内可稳定pH。一般说,结合分析得pH应处于生理范围,即pH=7-8。

钠、镁等离子在不同得受体系统中会有不同得影响。因此要根据具体目得决定选用与否。如果加入得受体蛋白量较少时,宜在缓冲液加入适量蛋白,使反应液内蛋白浓度为0、1mg-1mg/ml为好。为了阻止肽类得降解,常在分析时加入各种肽酶抑制剂。但要视具体就是哪种肽而定,以确保实际有效。因为有些蛋白酶抑制剂有抑制特异性结合得作用。五、结合体与游离配基得分离

受体-配基结合分析主要就是测定反应平衡时结合配基得量,求解受体得密度与平衡解离常数。反应一般在达到平衡后先经分离,再测结合部分得放射性。

理论上,一经分离,反应得平衡就会被破坏,所以选择适当得分离方法与环境,使受体-配基复合物在分离过程中得解离减少到最低限度。低温就是降低解离得最有效手段,分离快慢也就是重要因素。常用得分离方法有离心法、滤膜法、吸附法、透析法、电泳法等。若复合物解离快,则只能选择快速得分离方法。同时一定要在分离时间,分离温度等方面保持各样品管之间得一致性,以减少误差。

(一)抽滤法(滤膜法)

1、选用得滤膜材料:既能阻挡复合物又不要过多产生对游离标记配基得非特异性吸附。常用得滤膜就是玻璃纤维滤膜。

2、影响因素(1)复合物得解离:一般说,低温时解离较慢,故滤膜及缓冲液应保存于低温