微生物的选择培养和计数-辽宁省锦州市义县高年级中学人教版高中生物选择性必修3课件

义县高中刘占江微生物的选择培养和计数高压蒸汽灭菌液体培养基微生物的基本培养技术1、实验室培养微生物条件1）提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件—培养基2）确保其它微生物无法混入—无菌技术高压蒸汽灭菌温故知新：2、培养基的营养构成:碳源、氮源、水、无机盐等1）碳源：无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-有机碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物2）氮源：无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源3）无机盐：Ca、K、Mg为大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121℃,15～30min无菌的方法：接种室、接种箱，超净工作台课题背景自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群那么我们又如何达成这一目标呢？科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。二、微生物的选择培养和计数（一）选择培养基美国黄石国家公园的一个热泉

1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而提取出耐高温的DNA聚合酶。

为什么水生栖热菌能从热泉中筛选出来呢？

实验室微生物的筛选时，可人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。因为水生栖热菌能在70-80℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。培养基中加氨苄青霉素具有氨苄青霉素抗性的菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌培养基应有菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?举例1加入青霉素：不加氮源：不加含碳有机物：——分离出酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)——分离出固氮菌

——分离出自养型微生物补充资料1-几种选择培养基举例那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？思考-讨论选择培养基配方的设计尿素的立体结构

尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。讨论：1、你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素

的细菌分离出来？2、该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000mlKH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml配方一：培养细菌配方二：培养可以分解尿素的细菌

补充资料2-普通培养基与选择培养基的比较1、从物理性质看此培养基属于哪类？从用途上属于哪类培养基？固体培养基配方二是以尿素作唯一氮源的选择培养基2、此培养基中共有哪些成分？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：配方二氮源：成分：碳源、氮源、水、无机盐（二）微生物的选择培养如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。2、实验的具体操作：

2）土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌1）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基1、稀释涂布平板法是将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml1073）样品梯度稀释：微量移液器稀释10倍菌液101土壤10g在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。

分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。取6支试管，分别加入9ml无菌水。1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中滴2、取少量稀释液（不超过0.1ml

），滴加到培养基表面灼3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10s。涂4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照浸4）取样涂布平板：放入37℃恒温箱中培养1～2d5）培养与观察稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照恒温培养箱（三）微生物的数量测定稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。1、原理：2、计数原则：一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。实例分析1：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？3、计算：每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。（80+90+100）/30.1×105=9×107个

两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、

212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）

乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。实例分析2：1、显微镜直接计数：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数缺点：不能区分死菌与活菌不适于对运动细菌的计数（比例计数法）待测样品等量的已知含量的红细胞

混匀涂抹测定：

红细胞数目细菌数目计算单位体积内的细菌数目

将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。细菌红细胞2、显微镜直接计数是测定微生物的方法。

举例：已知红细胞浓度为M个/mL，从体积为NmL的大肠杆菌培养液中取出大肠杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？X＝N×M×YW(个)观察到的红细胞平均数/观察到的细菌平均数＝红细胞含量/细菌含量公式思考-讨论土壤中分解尿素的细菌的分离和计数尿素的立体结构课题目的1、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

2、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌研究思路土壤取样制备培养基样品稀释与取样涂布微生物的培养与观察1、土壤取样1）取样的位置：

土壤含有大量的微生物，，是微生物的天然培养基。细菌适宜在酸碱度接近

中性的潮湿土壤中生长，绝大多数的细菌分布距地表3∼8cm的土壤层。2）取样要求：先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2、制备培养基制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。3、样品的稀释测土壤中细菌数量，一般选用1x104

、1x105

和1x106倍的稀释液进行平板培养。4、微生物的培养与观察30-370C温度下培养1-2d，每隔24h统计一次菌落数。

3、操作提示2）无菌操作3）做好标记

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记4）制定计划对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。a、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。b、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入

锥形瓶中，塞好棉塞。c、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

结果分析与评价1、结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及