基因工程的基本操作程序1课件高二下学期生物人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序2.基因工程每一步涉及的技术和方法苏云金杆菌与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定1.基因工程的基本操作程序基因的结构非编码区（不转录）编码区（转录）启动子：在基因的上游终止子：在基因的下游调控转录过程外显子：转录后翻译，编码蛋白质的合成内含子：转录后被切除，不翻译原核生物：无内含子，其编码区是连续的真核生物：有内含子，其编码区是间断的、不连续的。

非编码序列：不能编码蛋白质的片段，包括非编码区和内含子编码序列：能编码蛋白质的片段，即外显子①②转录起点转录终点原核生物真核生物编码区（转录区）非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子外显子内含子基因结构示意图①目的基因——Bt基因1.目的基因的获取和筛选苏云金芽孢杆菌产生Bt基因伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)表达破坏鳞翅目昆虫的消化系统杀死棉铃虫棉花细胞导入抗虫棉培育1.概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因；如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关基因。主要是编码特定蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子；①筛选合适的目的基因方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。1.目的基因的获取和筛选如：Bt基因的筛选苏云金杆菌制成杀虫剂掌握目的基因的功能掌握目的基因的结构防治棉花害虫发现杀虫作用与Bt基因有关掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白)Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。筛选目的基因的技术手段：测序技术序列数据库(如GenBank)序列比对工具(如BLAST)测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。DNA测序仪核苷酸序列比对氨基酸序列比对美国国家生物信息中心越来越多基因的功能和结构被分析。1.目的基因的获取和筛选①筛选合适的目的基因目的基因获取方法从基因文库中获取通过DNA合成仪直接合成利用PCR获取和扩增目的基因②获取合适的目的基因：1.目的基因的获取和筛选基因组文库部分基因文库（主要是cDNA文库）基因文库：1.从基因文库中直接获取：基因组文库：含有某种生物全部基因片段的重组DNA的克隆群体。部分基因文库：含有某种生物部分基因片段的重组DNA的克隆群体。与载体连接导入受体菌群用适当限制酶切割（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA许多DNA片段该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA逆转录形成mRNA（某一发育时期）逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链cDNA(cDNA)与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库基因组文库中的基因含有启动子、终止子、内含子cDNA文库中的基因不含以上结构②获取合适的目的基因：1.从基因文库中直接获取：1.下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是(

)A．cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，基因组文库中含有某种生物的全部基因B．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同C．cDNA文库中的基因没有启动子D．一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种B目的基因的获取2.人工合成：DNA合成仪（1）前提：（2）方法：1.目的基因的获取和筛选②获取合适的目的基因：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因提取苏云金芽孢杆菌抗虫基因？快速获得大量抗虫基因3.利用PCR获取和扩增目的基因：PCR——聚合酶链式反应PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，通过在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。1.目的基因的获取和筛选发明者：穆里斯体内DNA复制要点回顾:条件原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）模板：DNA的两条链酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等能量：ATP复制原则:碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？3.利用PCR获取和扩增目的基因：1.目的基因的获取和筛选PCR扩增仪知道目的基因的两端核苷酸序列，基因又比较大前提：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶3.利用PCR获取和扩增目的基因：1.目的基因的获取和筛选1.体外PCR的条件：dATPdGTPdCTPdTTP引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。a.什么是引物1.目的基因的获取和筛选1.体外PCR的条件：

在DNA复制时，DNA聚合酶不能直接从模板链的一端直接开始台成子链，必须由引物提供3’端之后才能开始连接脱氧核苷酸。3’3’3’3’5’5’5’5’3’3’5’5’5’5’3’3’DNA解链为单链高温(95℃)变性低温(50℃)复性中温(72℃)延伸引物结合到互补DNA链Taq酶从引物起始进行子链的合成PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。2.PCR扩增目的基因的过程：1.目的基因的获取和筛选第1步：变性当温度超过90℃时，双链DNA解旋为单链。2.PCR扩增目的基因的过程：1.目的基因的获取和筛选5’3’3’5’5’3’3’5’①变性②复性③延伸冷却加热955072℃预变性90℃以上增加大分子模板DNA彻底变性的概率长度相同但C-G含量高的引物需要设定的复性温度较高。当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。2.PCR扩增目的基因的过程：1.目的基因的获取和筛选5’3’3’5’第2步：复性①变性②复性③延伸冷却加热5’3’3’5’当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。2.PCR扩增目的基因的过程：1.目的基因的获取和筛选①变性②复性③延伸冷却加热5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’第3步：延伸第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。2.PCR扩增目的基因的过程：1.目的基因的获取和筛选①变性②复性③延伸冷却加热5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’每次循环后目的基因的量可以增加一倍，即形成指数式扩增(2n)。1、复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？思考：

复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。1.目的基因的获取和筛选PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所引物酶温度结果联系解旋酶催化，边解旋边复制高温变性解旋，全部解旋后再复制主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)RNA通常是DNA解旋酶、DNA聚合酶等耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）细胞内温和条件在不同温度(较高)下进行合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板③原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）②酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链1.目的基因的获取和筛选1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法

B、基因组文库法C、cDNA文库法

D、聚合酶式链反应2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因

③逆转录法