DB15T 3551-2024呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程

15I1呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程2PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSolution)VS:玻璃化冷冻液(VitrifiedSolution)精子活力≥70%、密度≥0.8×10个/mL、畸形率≤15%,颜色为乳白色。离心处理后的精子，用I液稀释至2×108个/毫升，在4℃冰箱平衡2h后，再用等体积II液稀释至1在4℃条件下，将精液分装到0.25mL细管中，另一端封口。5.7冷冻利用程序冷冻仪，在4℃~-35℃温区，设置6℃/min的降温速率；在-35℃~-100℃的温区，设置20℃/min的降温速率，然后投入液氮。将液氮倒入深度50cm以上的泡沫箱预冷10min,细管铺放在取出冻精细管，室温空气浴5s,然后放置于40℃水浴10s取出，无菌纸巾擦干备用。36.1冷冻方法6.2卵母细胞选择挑选至少有3层卵丘颗粒细胞的COCs,体外成熟24h后，在含0.1%(w/v)透明质酸酶中消化，去除卵丘颗粒细胞，挑选胞质均匀、折光性好、排出第一极体的裸卵。6.3试剂与溶液按照附录A中表A.2规定的配方配制。将0.25mL细管加热变软后拉成为管壁内径为0.2mm,管壁厚0.02mm的OPS管，冷却后用手术刀片在其细端切开，细端长度约2cm。6.4.2冻前准备玻璃化冷冻液及使用器材在室温25℃至少预热30min,在培养皿中制作100μL～200μL的VS1和VS2液滴。保温杯倒入液氮，15ml离心管壁扎眼儿、贴标签、记录羊只信息、卵母细胞质量和数量、日期等，放入保温杯中，用于OPS的收集。将卵母细胞在VS1液中平衡30s,再移入VS2液中平衡不超过25s,将多枚卵母细胞及少量VS2吸入OPS中，投入液氮保存。解冻液及使用器材在室温25℃至少预热30min。在一个培养皿中加入2ml的TS1液，在另一个培养皿中分别制作200μLTS1、TS2、TS3解冻液微滴，置于37℃恒温台上，至少预热10min。取出OPS,迅速插入盛有TS1的培养皿中，排出卵母细胞并计时。将卵母细胞移入TS1微滴孵育1min,然后移入TS2微滴孵育5min,再移入TS3微滴孵育5min,将卵母细胞在培养液中洗涤3～5次，置于二氧化碳培养箱中复苏0.5h~2h,备用。7胚胎冷冻保存7.1冷冻方法程序冷冻仪法。7.2胚胎选择选择1、2级桑葚胚至扩张囊胚，胚胎质量鉴定按照NY/T1674的规定执行。47.3溶液配置按照附录A中表A.3规定的配方配制。7.4标记按照DB15/T3401的规定执行。7.5胚胎回收回收到装有胚胎保存液并编号的平皿中。7.6洗涤胚胎在胚胎保存液滴中洗4次，放入做好标记的平皿中，30min内必须开始冷冻。胚胎在S1和S2液中平衡5min,在1.5M乙二醇中平衡10min。7.8冷冻按照DB15/T3401的规定执行。7.9贮存将细管装入相应的拇指管内，放入液氮罐中保存。胚胎细管从液氮中取出，空气浴2s~3s后，放入32℃水浴10s。把胚胎放入T液中平衡5min,然后把胚胎移入胚胎保存液平衡5min,并洗3次，备用。5A.1精液冷冻保存溶液配方