重组DNA技术的基本工具-高二生物课件（人教版2019选择性必修3）2

第3章

基因工程第1节重组DNA技术的基本工具新课程标准核心素养1.简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3.进行DNA的粗提取与鉴定。1.科学思维——模拟重组DNA分子的操作过程，说出合成新DNA分子的基本原理。2.社会责任——关注基因工程的社会议题，参与讨论基础理论和技术发展如何催生了基因工程。1．基因工程的诞生和发展(1)基因工程的诞生①1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌转化实验证明了遗传物质是________，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。②1953年，沃森和克里克建立了___________________模型并提出了遗传物质自我复制的假说。③1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的____________。④20世纪70年代初，多种限制酶、_____________酶和逆转录酶被相继发现，为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。⑤1973年，科学家证明__________可以作为基因工程的载体，构建____________，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。DNADNA双螺旋结构密码子DNA连接质粒重组DNA一、基因工程的诞生与发展(2)基因工程的发展①1982年，第一个基因工程药物___________________被批准上市。②1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条

_______________。③1985年，穆里斯等人发明______，为获取目的基因提供了有效手段。④1990年，__________计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。⑤21世纪以来，科学家发明了多种_________________，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因序列的了解。⑥2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的__________技术编辑了哺乳动物基因组。重组人胰岛素转基因鱼PCR人类基因组高通量测序技术基因组编辑项目具体内容操作对象基因原理_________操作环境操作水平_________结果获得_____________的新的生物类型和生物产品优点克服_______________的障碍;_________生物性状基因重组分子水平符合人们需要远缘杂交不亲和定向改造2.基因工程的概念生物体外思考讨论：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？普通棉花抗虫棉？一、限制性核酸内切酶

——“分子手术刀”1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来

2、种类：现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内切酶(限制酶)。3、作用特点：具有专一性，表现在以下两个方面4、作用部位:特定切点上的磷酸二酯键5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯键①能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。②能够切割特定序列中的特定位点。5、两种常用的限制酶：限制酶的命名是根据细菌种类而定，以EcoRI为例:

E：Escherichia(属)

co：coli(种)

R：RY13(品系)

I：首先发现在此类细菌中发现的顺序EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichiacoli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分离出的第一个限制酶。EcoRⅠ和SmaⅠ黏性末端黏性末端（1）EcoRI限制酶的切割:被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。中轴线（2）SmaI限制酶的作用只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。在C和G之间切开6、结果：产生黏性末端或平末端思考讨论1：仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。思考讨论2：

原核生物很容易受到自然界中外源DNA的入侵，但是长期的进化过程中，这些原核生物却没有因为外源DNA的入侵而灭绝。你推测这其中的原因是？

原核生物细胞中的限制酶会将外源DNA切割掉，使之失效，以保证自身的安全，但是不会切割自身的DNA，这是原核生物在长期进化过程中形成的一套防御机制。……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因练习：使用EcoRI剪切目的基因1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考讨论3：G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同种限制酶切割(EcoRⅠ)3.把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？

缺口怎么办？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G二、DNA连接酶——分子缝合针1.作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，2.种类：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶ATAGTCCGAATT连接两个DNA片段3.与DNA聚合酶区别：CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶连接单个脱氧核苷酸形成单链DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键3.与DNA聚合酶区别：根据所学知识，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切断a处的酶为_______

B.连接a处的酶为_______C.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键；b：氢键练习：质粒（最常用）将外源基因送入受体细胞。1.作用：动植物病毒λ噬菌体的衍生物2.种类：质粒三、基因进入细胞的载体——分子运输车

质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。3、运载体需具备的条件（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存（2）有一个至多个限制酶切点（3）有某些标记基因（4）对受体细胞无害、易分离能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；便于与不同目的基因结合便于鉴定和筛选有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。补：标记基因对重组DNA的鉴定和选择原理标记基因通常有:①抗生素的抗性基因，如:抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)②荧光蛋白基因，如:绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低质粒的特点质粒是基因工程中最常用的运载体最常用的质粒是大肠杆菌的质粒细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子存在于许多细菌及酵母菌等生物中质粒的存在对宿主细胞无影响质粒的复制只能在宿主细胞内完成4、质粒的特点：真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…实例：重组DNA分子的模拟操作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…【典例】图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）上述操作中不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和_____________。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________。目的基因抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。方法总结：---选择酶切位点的原则(1)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(2)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(

)(3)E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(

)(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(

)(5)质粒是双链环状DNA分子，是基因工程常用的载体。()××××√【基础过关】【典例1】如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法正确的是(

)限制酶BamHⅠEcoRⅠHindⅡ识别序列和切割位点G↓GATCCG↓AATTCGTY↓RAC限制酶KpnⅠSau3AⅠSmaⅠ识别序列和切割位点GGTAC↓C↓GATCCCC↓GGG(注：Y表示C或T，R表示A或G)DA.一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列B.限制酶的切割位点一定位于识别序列的内部C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D.限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端【典例2】下列关于质粒的叙述，正确的是（）A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B.质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA分子C.质粒只有在侵入宿主细胞后在宿主细胞内复制D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行E.质粒是基因工程中唯一的运载体B【典例3】用限制酶EcoRⅤ单独切割某质粒，可产生1个14kb(1kb即1000个碱基对)的长链，而同时用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ联合切割该质粒，可得到三种长度的DNA片段，见下图(其中*表示EcoRⅤ切割后的一个黏性末端)。若用MboⅠ单独切割该质粒，则产生的DNA片段的长度为(

)A.2.5kb和5.5kb B.2.5kb和6kbC.5.5kb和8kb D.6kb和8kbD限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、λ噬菌体衍生物

、动植物病毒基因工程的