重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版选择性必修33

为了棉花姓“中国”1992年，一场史无前例的棉铃虫灾害吞噬着中国的棉田，我国棉花产业遭遇灭顶之灾；国外公司拒绝出售抗虫棉核心技术，到1999年外国抗虫棉已占领我国95%的棉花市场份额，国内棉花品种市场迅速流失。1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种——中棉所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%；2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种——中棉所41，该品种能够缓解棉铃虫抗药性，我国成为世界第二个拥有抗虫基因自主知识产权的国家！第3章基因工程

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。

（1）原理：

（2）操作水平：

（3）操作环境：

（4）操作对象：

（5）结果：基因重组。分子水平。生物体外。基因。赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

（6)优点：定向改造生物体的性状，目的性强（与诱变育种相比）育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍（与杂交育种相比）2.图解“基因工程实质”转移A生物B生物萤火虫普通动植物发光基因第1节基因工程的工具

第三章基因工程本节聚焦:重组DNA技术的3种基本工具是什么？

它们各具什么作用？基因工程载体需要具备什么条件？

重组DNA技术所需的三种基本工具“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞基因工程诞生的理论基础1.拼接的基础：2.表达的基础：(1)DNA的基本组成单位都是

。(2)DNA分子都遵循

原则(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的

。四种脱氧核苷酸碱基互补配对双螺旋结构(1)基因是控制生物性状的结构和功能单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？1.简称：限制酶2.来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。一、限制性内切核酸酶——分子手术刀3.限制酶的命名：

用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichiacoli)的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoRI。两种常用的限制酶：EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichiacoli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分离出的第一个限制酶。EcoRⅠ和SmaⅠ一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”4.作用(特点)：

识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。ATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯键5.作用部位：特定切点上的磷酸二酯键G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A磷酸二酯键（特异性）你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。

所以，简单来说：限制酶在原核生物中起到的作用为：切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的P74拓展应用：试推测限制酶为什么不会切割自身的DNA？一、限制性内切核酸酶——分子手术刀提示：含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上（识别序列已被修饰），使限制酶不能将其切开。思考仔细观察以下四种限制酶识别的特定序列有何特点？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。6.限制酶所识别的序列的特点：7.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——_________和_______黏性末端平末端①当限制酶在它识别序列的___________将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是__________；②当限制酶在它识别序列的________切开时，产生的是______；中轴线两侧黏性末端中轴线处平末端一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”12

黏性末端

黏性末端只能识别5‘GAATTC3’序列，并在G和A之间切开。被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。EcoRI限制酶的切割：平末端平末端SmaI限制酶的作用：只能识别5‘CCCGGG3’序列，并在C和G之间切开。当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。练习使用EcoRI剪切目的基因……TACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因1.要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？2.如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。会产生相同的黏性(平)末端思考思考与讨论4.请写出下列限制酶切割形成的黏性末端，并思考同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？提示

如图同种限制酶产生的黏性末端相同，不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。5.以下黏性末端是由__种限制酶作用产生的3学以致用思考与讨论3.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？不能(2)请结合右图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？消耗2分子水。断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；6.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—酶切结果：BamHⅠ，

。Sau3AⅠ，

。形成一个切口形成两个DNA片段使用

（限制酶）提取目的基因Sau3AⅠG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同种限制酶切割(EcoRⅠ)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？思考

缺口怎么办？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G思考两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来二、分子缝合针—DNA连接酶1.作用：注意：用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）DNA连接酶能够将DNA片段连接起来2.种类：⑴E.coliDNA连接酶：⑵T4DNA连接酶：连接平末端效率远远低于T4DNA连接酶DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶拓展：几种相关酶的比较名称作用部位作用结果限制酶

DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键碱基对之间的氢键将DNA切成两个片段磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链5.以下黏性末端是由__种限制酶作用产生的3学以致用思考与讨论3.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？不能(2)请结合右图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？消耗2分子水。断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；质粒:将外源基因送入受体细胞,使目的基因能够在受体细胞中进行大量复制。1.作用：动植物病毒:噬菌体:2.种类：将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入动植物细胞将外源基因导入大肠杆菌等细胞动物病毒噬菌体三、基因进入受体细胞的载体大肠杆菌及质粒结构模式图三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”3.作为载体需具备的条件（1）有一个至多个限制酶切割位点目的：供外源DNA片段（基因）插入其中。（2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，

随受体DNA同步复制。（3）常有特殊的标记基因

（如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等）目的：便于重组DNA分子的鉴定和筛选。（4）对受体细胞无害，大小合适、方便操作。有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。不能被酶切破坏能复制，并带着插入的目的基因一起复制是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我

能力的环状双链DNA分子。有切割位点最常用的载体

—质粒：复制真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过

改造的。人工30标记基因的筛选原理：载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。（据图请尝试描述筛选的过程）关键点拨培养基中有几种类型的大肠杆菌？什么样的大肠杆菌能够在该培养基上存活并繁殖？基因工程中的载体细胞膜上的载体蛋白本质作用基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别DNA分子蛋白质携带外源基因进入受体细胞中，并在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制运载要进出细胞的特定物质思维拓展6.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—酶切结果：BamHⅠ，

。Sau3AⅠ，

。形成一个切口形成两个DNA片段使用

（限制酶）提取目的基因Sau3AⅠ…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG重组DNA分子重组DNA分子1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对?如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。注意：同种限制酶不一定是同一种限制酶(比如同两种）。要保证切割目的片段和载体用的酶相同，这样才能进行下一步的拼接。…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5.从以上操作可推知，在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切

割___次此DNA分子，断

个磷酸二酯键,产生____个末端,出现____个游离

的磷酸基团。6.切割目的基因和载体时，需要用_______限制酶,目的是_______________7.目的片段翻转过来，可以连接吗？____8.目的片段可以自身环化吗？_____9.如何防止目的基因自身环化、防止目的基因反向连接到载体：244同种产生相同的黏性末端可以可以用不同的限制酶（通常两种）切割目的基因的两侧及质粒，使之产生不同的黏性末端。重组DNA分子4【例1】①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是

。SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因确保目的基因与质粒的正确连接防止目的基因、质粒的自身环化及防止目的基因反向连接到载体【思考3】用限制酶切割时需注意的事项(3)选择限制酶切割位点的基本原则：

①切割目的基因时：

。

②切割质粒时：

。能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选实验：DNA的粗提取与鉴定1、实验原理DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精溶液但某些蛋白质溶于酒精DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液在一定温度下（沸水浴），DNA被二苯胺试剂染成蓝色初步分离DNA和蛋白质溶解DNA鉴定DNADNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菜花和猪肝等。

（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）(1)选材：(2)试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用2、材料用具实验：DNA的粗提取与鉴定实验：DNA的粗提取与鉴定称取洋葱，切碎，放入研钵，倒入研磨液，充分研磨。破碎细胞目的：裂解细胞，释放DNA过滤在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液。问题1:过滤能否用滤纸代替纱布？

不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。问题2:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。3、实验步骤低温放置几分钟的作用

抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；破碎细胞过滤DNA的析出在上清液中加入体积相等的预冷的酒精溶液,静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。问题3:此步骤的目的是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。问题4：酒精预冷的作用？①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。实验：DNA的粗提取与鉴定3、实验步骤破碎细胞过滤DNA的析出用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。问题5：搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子析出DNA实验：DNA的粗提取与鉴定3、实验步骤实验组对照组水浴加热破碎细胞过滤DNA的析出DNA的鉴定将丝状物或沉淀物溶于

溶液中，加入

试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min二苯胺2mol/L的NaCl空白对照：

在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。评价结果：（1）DNA纯度看提取物颜色（2）DNA的量看与二苯胺反应颜色的深浅现配现用！实验：DNA的粗提取与鉴定3、实验步骤（1）你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？

观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。

本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。（2）你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？4、结果分析与评价

实验：DNA的粗提取与鉴定实验组水浴加热5min，冷却后对照组蓝色

1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。思考鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。(1)通过基因工程产生的变异是不定向的