新教材高中生物选择性必修3课件：第3章 实验突破(二) DNA片段的扩增及电泳鉴定(人教版)

实验突破(二)

DNA片段的扩增及电泳

鉴定一、实验原理1.DNA片段的扩增利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。2.琼脂糖凝胶电泳(1)带电粒子：DNA分子具有

的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

或

。(2)迁移动力与方向：在

的作用下，带电分子会向着与它所带电荷

的电极移动，这个过程就是电泳。(3)迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的

、DNA分子本身的

和

有关。(4)检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的

灯下被检测出来。可解离正电荷负电荷电场相反浓度大小构象紫外二、方法步骤1.移液：用

按照配方或PCR试剂盒的说明书，在__________中依次加入各组成成分。2.混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。3.离心：将微量离心管放在离心机上，离心约

s，使反应液集中在管的

。4.反应：将装有反应液的微量离心管放入

中，设置程序进行反应。5.根据待分离的DNA片段的

，用

配制合适的琼脂糖凝胶，一般配制质量体积比为

的琼脂糖溶液，并加入适量的

染料混匀。微量移液器微量离心管10底部PCR仪大小电泳缓冲液0.8%～1.2%核酸6.将扩增得到的PCR产物与

(内含指示剂)混合，再用____

将混合液缓慢注入加样孔。7.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为___

。待指示剂前沿迁移接近

时，停止电泳。8.电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。凝胶载样缓冲液微量移液器1～5V/cm凝胶边缘三、操作提示1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。四、关键点拨1.PCR中的解旋过程：PCR过程中

(填“需要”或“不需要”)解旋酶，需要通过

打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。2.PCR需要

种引物，它们分别是能与两条DNA母链的一段碱基序列互补配对的核酸单链。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，引物自身不能有连续4个碱基的互补序列，两种引物之间不能有连续4个碱基的互补序列。3.PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的

。不需要升高温度两概率4.判断DNA扩增成功的方法：(1)可以通过计算

来评价扩增的效果。(2)

检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。DNA含量电泳例1用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，两种引物及其与模板链的结合位置如图所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，下列叙述错误的是A.第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个B.第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个C.第三轮复制得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个X基因D.第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因√第三轮复制得到8个DNA分子，①复制得到①和③，③复制得到③和⑤，②复制得到②和④，④复制得到④和⑤，故得到①和②各一个，③和④各两个，⑤两个且等长，即2个X基因，C正确；第四轮复制得到16个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，两个③复制得到两个③和两个⑤，两个④复制得到两个④和两个⑤，两个⑤复制得到四个⑤，故第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个X基因，D错误。解析第二轮复制得到4个DNA分子，①复制得到①和③，②复制得到②和④，故得到①②③④各一个，B正确；例2用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是A.PCR产物的分子大小在250～500bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号确定反应体系等对结果没有干扰√解析PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500bp，A正确；3号PCR结果包含250～500bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。1.(2019·合肥一六八中学月考)利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过程中，下列叙述错误的是A.引物越短，PCR扩增出来的非目标DNA就越多B.适温延伸过程中，需要提供ATPC.引物中G/C含量越高，变性温度越高D.共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成跟踪训练123456√解析引物越短越有可能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应，引物越短，PCR技术扩增出来的非目标DNA就越多，A正确；PCR技术扩增DNA的适温延伸过程中，不需要提供ATP，B错误；引物中G/C含量越高，DNA模板中G/C含量越高，高温变性的温度就越高，C正确；PCR技术的原理是DNA复制，共有(2n－1)对引物参与子代DNA分子的合成，D正确。1234562.下列关于电泳的说法，错误的是A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C.DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度有关D.用琼脂糖凝胶电泳，DNA的电泳迁移速率完全取决于分子的大小123456√解析

DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子本身的大小和构象有关。3.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物A.第一次循环

B.第二次循环

C.第三次循环 D.第四次循环123456√解析在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示。因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。1234564.一对等位基因经某种限制性内切核酸酶切割后形成的DNA片段长度存在差异，凝胶电泳分离酶切后的DNA片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱。根据该特性，就能将它作为标记定位在基因组的某一位置上。现有一对夫妇生了四个儿女，其中1号性状特殊(如乙图)，由此可推知这四个儿女的基因型(用D、d表示)正确的是A.1号为XdXd

B.2号为XDYC.3号为Dd D.4号为dd123456√1234565.聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题：(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将含有_________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的______开始延伸DNA链。(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到____________________，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫__________。磷酸基团3′端耐高温的DNA聚合酶选择培养基123456(3)PCR的每次循环可以分为________________三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有___个这样的DNA片段。变性、复性和延伸326.如图是利用PCR技术和电泳技术进行的某一次亲子鉴定结果图谱，请根据图谱和所学知识回答下列问题：123456(1)PCR技术能把某一DNA分子片段进行扩增。它是利用了DNA的______原理，通过控制____来控制DNA____与结合。热变性温度解旋(2)利用PCR技术扩增DNA的过程中还需要_________________酶的作用，但它必须在相应的____的作用下才能完成对DNA的复制。假设有一段DNA序列为：5′—GTTAACCTTAG—3′3′—CAATTGGAATC—5′所用引物Ⅰ为5′—GTTA—OH，则引物Ⅱ为________________。123456耐高温的DNA聚合引物5′—CTAA—OH(3)图①是含有21个氨基酸的多肽水解得到的氨基酸混合物电泳的结果，故可推知该多肽由___种氨基酸构成。123456(4)图②为某小孩和其母亲，以及待测定的四位男性的DNA，分别由酶处理后，生成若干DNA片段，并进行扩增，然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱，请分析：F1～F4中，你认为___是该小孩真正生物学意义上的父亲。为什么？____________________________________________6F2因为C和F2两者之间的DNA指纹图谱有相同的区段123456氨基酸混合物进行电泳时，因为相同的氨基酸相对分子质量和所带电荷数相同，所以在电泳时只出现1个条带，图①所示图谱出现6个条带，所以该多肽由6种氨基酸组成。从