慢病毒载体构建、病毒包装实验操作手册

慢病毒载体构建、病毒包装实验操作手册

一、简介

慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治

疗载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全

性高。我们提供的慢病毒为复制缺陷型病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，

也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的

基因所取代,属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，我们建议不要

使用编码已知或可能会致鹿的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌

性，否则均不建议采用彳鲤病毒进行生物学实验。

复百澳公司所用的慢病毒载体是在Clonetech公司的慢病毒包装系统上改进而来。包

括载体质粒(PFV：PLVX)、辅助质粒psPAX2(pHelper1)和辅助质粒pMD2G(pHelper2)

三种质粒组成。载体质粒PFV载体中含有HIV的基本元件5'LTR和3'LTR以及其他辅

助元件。通常根据不同的实验目的针对载体质粒进行改造来进行启动子活性研究、基因表

达研究?口RNA干扰等研究。pHelper1载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的

结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调

节因子。pHelper2载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因,提供病毒包装所需要的

包膜蛋白。

本手册为复百澳公司慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家

交流使用,部分细节内容未能做到一详述,敬请谅解.同时希望大家能够针

对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。

服务及实验流程

1.病毒包装服务流程图

客户提供公司服务

呼酒潘.德

2.病毒包装实验操作流程图

三质粒共转病毒上清液超速

293T细胞离心浓缩纯化

24H第一次收毒换液慢病毒质检

48H第二次收毒

三、实验材料

1.细胞株：293T细胞，用于病毒包装。

2.大肠杆菌菌株：TOP10,用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

3.病毒载体质粒：载体质粒、pHelper1质粒和pHelper2质粒

4.试剂：

试剂名称试剂来源-

胎牛血清胎牛血清Sh30084.03

DMEM（高糖）HycloneSh30022.01B

胰酶HycloneSH30042.01

Lipofectamine2000Invitrogen11668-500

限制性内切酶NEB

NEBLife15224-041

5.仪器

仪器名称仪器来源cat.No.

荧光显微镜LeicaDMILLED

C02培养箱力康生物医疗科技控股有限公司HF90

生物安全柜力康生物医疗科技控股有限公司HFsafe-1200TE

超速离心机beckmanoptimal-90K

微量高速离心机ThermoPICO17

四、质粒构建

1.目的基因合成和干扰序列设计

示例1.过表达基因克隆构建：EPO基因（human）的全基因合成。

MCS_ATGGGGGTGCACGMTGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTCGCTCCCT

CTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGT

ACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGA

ATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGG

GCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCA

GGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTC

AGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCC

CTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTC

CGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCAGGACA

GGGGACAGAGGTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAG

GACTATAAGGATGATGACGACAAAGCTAGCTAA-MCS-

示例2:基因干扰克隆构建：nucleolin基因干扰腺病毒设计

1）干扰序歹！J设计:shRNA:GGATGAAGATGAAGAGGATGA

2)合成shRNAoligo

ShRNA-1

CCGGGGATGMGATGMGAGGATGACTCGAGTCATCCTCTTCATCTTCATCCTTTTTTG

shRNA-2

AATTCAAAAAAGGATGAAGATGAAGAGGATGACTCGAGTCATCCTCTTCATCTTCATCC

3)退火体系：

名称体积

Oligo1(100pM)1ul

Oligo2(100pM)1ul

10XT4LigationBuffer(NEB)2ul

ddH2015ul

T4PNK(NEBM0201S)1ul

total20ul

37℃30分钟，95℃5分钟，然后按照5℃/分钟的速度降至25℃。

2.教体前切：

名称体积

ddH2OXpL

10Xbuffer1ML

纯化的DNA质粒载体1Mg

NEB内切酶I0.5|JL

NEB内切的II0.5|jL

Total20ul

3.载体和目的片段链接

按摩尔比配制连接体系:目的片段：载体=3:1

名称体积

酶切回收质粒Xul

稀释后退火引物（或合成Yul

的目的基因）

5XT4DNALigaseBuffer2ul

T4D\ALigase(5U/ML)1ul

total10ul

4.质粒转化

1）50ulDH5a感受态放冰上融化，取2ul连接产物和感受态细胞混匀；

2）冰浴30min,42°C水浴热击90sec,冰浴2min;

3）转化产物转移到含500ul无抗性LB液体培养基的EP管中，置于摇床中，37℃,250

转/分，培养30分钟；

4）将含有转化菌的EP管,16000G离心Imin;

5）在超净台中倒去上清，将沉淀均匀涂于LB培养平板（Amp+）;

6）将平板倒扣置于37℃细菌培养箱培养过夜（12~16H）。

2.单克隆培养与鉴定

1）从上述平板中拟微单克隆菌落于5mlLB液体培养基中，37℃,250

转/分，培养过夜（12~16H）;

2）质粒提取（按照天根质粒提取试剂盒说明书提取）

3）质粒测序鉴定，将测J序结果与设计序列进行比对鉴定。鉴定结果正确的质粒,进行后

续病毒包装实验。

五、病毒生产部分

（-）病毒包装

1.24h,用胰蛋白酶消化又擞生长期的293T细胞,重新接种于10cm细胞培养皿，

37℃、5%CO2培箱g内培养，待细胞密度达70%~80%时即可用于转染；

2.转染前2h将更换细胞培养基培养基；

3.向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液（载体质粒10pg,pHelper1.0载体5p

g,pHelper2.0载体5pg）,与相应体积的Opti-MEM混合均匀,调整总体积为0.5

ml,在室温下温育5分钟。

4.取50ulLlpofectamlne2000试剂与450ulOptl-MEM混合,在室温下温育5分钟c

5.把稀释后的DNA与稀释后的转染试剂混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。

6.混合后，在室温下温育10分钟。

7.将上述转染混合物滴加到293T细胞培养液中，摇匀，于37°C,5%C02

8.细胞培养箱中培养。

9.培养6-8h后倒去含有转染混和物的培养基,每盘细胞更换10ml的10%FBS完全

培养基,37°C、5%C02培养箱内继续培养。

10.转染后24H,用显微潦观察含标签荧光（GFP/RFP）细胞的数量判定转染效率。

11.确定转染成功后（荧光细胞比例70%），进行第一次收毒操作。收集细胞培养基于一

个无菌50ml离心管中，4。（：保存。更换新鲜的10%FBS培养基10ml,继续培养24HO

12.转染后48H,进行二次收毒操作。收获含病毒培养基于无菌50ml离心管，4。（：保存。

（二）病毒浓缩纯化

1.将收获的含病毒颗粒的培养基，经过0.22um滤膜过滤并收集于无菌超速离心管中，

配平、密封；

2.超速离心80,000g,离心4H;

3.弃去离心后上清，用Virusstorebuffer（复百澳™）重悬沉淀；

4.收集重悬液,再次经过0.22um滤膜过滤除菌，分装于无菌病毒管中；

5.每个病毒管上贴好相应的标签，转于-80℃冰箱保存，

（=）滴度检测

1.实验前24H,接种HEK293T细胞于96孔板中,约1*103个/孔，503/孔,于37℃,

5%C02条件下培养；

2.实验前在显微镜下，对实验用细胞进行观察，确定细胞饱满、分部均匀、无污染后再

进行后续实验。

3.病毒梯度稀释：

1）准备1个新的96孑饭，由