血液中转氨酶活力的测定实验报告

一、研究背景及目的转氨酶是生物体内重要的一类酶，它催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间的相互转化，生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸，这种作用被称为转氨基作用。体内除了赖氨酸、苏氨酸外，其余α-氨基酸都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶，其中以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。GPT催化的是谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，GOT催化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，草酰乙酸在柠檬酸苯胺溶液中可以转变为丙酮酸与二氧化碳。GPT与GOT活性的测定在临床上有着重要应用，可作为一些疾病诊断的指标。例如，测定GPT活力可诊断肝功能的正常与否，急性肝炎患者血清中GPT活力可明显地高于正常人；而测定GOT活力则有助于对心脏病变的诊断，心肌梗塞时血清中GOT活性显示上升。本实验以动物的新鲜肝脏和血清为材料，分别测定其中的GPT的活性，以此来研究该转氨酶活性的测定方法。二、实验原理由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高，易于测得，且动物或人的转氨酶活性的测定应用广泛、技术成熟，因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验材料，对其中的一种重要转氨酶——GPT的活性进行测定。转氨酶活性测定的历史沿革建立了金氏法、穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法，本实验采用的是金氏法。该方法对转氨酶活力的定义是：血清在37℃条件下，与底物作用60min后，每生成1μM丙酮酸为一个转氨酶活性单位。丙酮酸含量的测定运用的是比色法。丙酮酸可与2，4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，所以通过测定溶液在520nm下的光吸收值并与标准溶液比色便可计算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量对应于一定的转氨酶活力单位。三、材料、试剂与仪器材料新鲜家兔肝脏和血清。试剂磷酸盐缓冲液：甲液为1/15mol/L磷酸氢二钠溶液，乙液为1/15mol/L磷酸氢二钾溶液。取甲液825ml，乙液175ml，混合，测得pH合适即可。贮存于冰箱中备用，可保存一周时间。2，4-硝基苯肼溶液：称取2，4二硝基苯肼20mg，先溶于10ml浓盐酸中，再以蒸馏水稀释至100ml，棕色试剂瓶内保存。丙酮酸标准液：精确称取丙酮酸钠22mg。柠檬酸苯胺溶液：取柠檬酸50g溶于50ml蒸馏水中，再加苯胺充分混合即可，低温出现结晶时，可置于37℃水浴中溶解后应用。氢氧化钠溶液。仪器DK-S24型电热恒温水浴锅、TPL-4OB低温台式离心机、722光栅分光光度计、大龙系列加样器及吸头、JP-100架盘药物天平、配平天平、刻度试管、离心管、小烧杯、匀浆器、洗瓶、冰浴。四、操作步骤样品准备取健康家兔，处死。心脏采血，分装至离心管，4000转低温离心15min，取上清液冰浴待用。取2ml肝脏研磨液1，用磷酸盐缓冲液定容至4ml，冰浴，记为肝脏研磨液2。实验操作取6支试管，编号，按特定要求操作。再取18支试管，分为三组，每组6支，分别用于测定血清、肝脏研磨液1、肝脏研磨液2的GPT活性，6支试管中3支作为测定管，另外3支作为对照管。五、数据整理分别记录血清中GPT活性的测定数据、肝脏研磨液1中GPT活性的测定数据以及肝脏研磨液2中GPT活性的测定数据。六、结果计算与分析根据标准曲线方程计算各三种样品光吸收值对应的酶活。实验结果显示：血清中GPT活性较高，而肝脏中的GPT活性特别的高，尽管稀释了一定的倍数，仍然超出了标准曲线设定的范围。研磨液2是由研磨液1稀释2倍得到的，但其活性完全与稀释倍数不成比例。推测原因如下：肝脏中GPT活性过高，催化反应中GPT过量，其活性没有得到完全的体现，所以稀释后活性没有按稀释倍数降低。肝脏研磨液稀释倍数不够，使得产物浓度超出了比色法的线性范围，最终导致通过标准曲线方程计算得到的酶活单位存在较大误差。七、结论与展望通过以上的计算与分析，本实验得到的结论是：通过比色法测定一定时间内转氨酶催化反应的产物的含量来表征转氨酶的活性的方法是可行的，关键的问题在于如何确定底物及酶的浓度从而使得酶的活性得到最大程度的发挥且底物浓度适于比色法的测定。本实验中由于肝脏中转氨酶活性过高，稀释倍数不够，导致产物浓度过大，超出了比色法的最适测定范围，得到的数据误差较大。所以希望以后的实验能够调整肝脏研磨液的