合成基因（或蛋白质）网络学习资料

合成基因（或蛋白质）网络Syntheticgene/proteinnetwork李琬生物物理教研室分子生物学馆212liwan@合成基因网络通过化学合成、基因工程和生物工程等手段，将人工设计合成的基因连接成网络，并在细胞中表达各种人为设计的信号分子，将所表达的各种信息按要求传递，相互调控信号途径。具有广泛的应用前景。合成基因（或蛋白质）线路合成基因（或蛋白质）网络定向进化基因线路与网络合成基因线路与网络的应用△※△※△合成基因（或蛋白质）线路（circuit）遗传线路，俗称基因线路借鉴电磁学中电器件关系线路的描述方法由各种调节元件和被调节的基因组合而成的遗传装置，可以在特定条件下定时定量地调控表达基因产物。逻辑基因线路功能基因线路△△※逻辑基因线路

（logicgenecircuit）起源于数字电路中逻辑运算的思想借鉴控制理论和逻辑电路的设计规则研究基因线路的逻辑关系与调控方法。模拟各种数字元件的功能，研究基因线路中的噪声传播和相应机制等。△※（1）逻辑门（2）遗传拨动开关（3）遗传振荡器（4）可存储基因模块（1）逻辑门（Logicgates）数字电子线路的基本内容最基本的运算单元执行逻辑运算AND门RNA聚合酶

与启动子结合的

亲和力很低，基础

转录相对较小激活因子亲和力较低，无法与操纵子

结合激活因子诱导物改变构象与操纵子结合帮助RNAp与启动子结合异丙基-β-D硫代半乳糖苷脱水四环素带有记忆功能（memory）的AND门由于表达产生的CI始终能够抑制LacI和TetR的产生，因此，体系将始终维持上述状态，与诱导剂浓度无关。OR门（2）遗传拨动开关(slideswitch)双稳态开关振荡电压、电流或其他电量的幅度随时间而反复变化的物理现象。这种变化通常是周期性的。（3）遗传振荡器(Repressilator)基因振荡一种基因调控机制生物生理节奏源于其自身细胞内特定蛋白质浓度的周期性变化，由振荡的幅度和周期来决定基因表达的时间基因水平的振荡器对于调节细胞周期、生理节奏等细胞学行为起着非常关键的作用。将三个表达产物相互抑制的基因串联成一个环状结构，利用基因之间的抑制和去抑制效应就可以实现遗传振荡器的构建。SynthesizingANDgategeneticcircuitsbasedonCRISPR-Cas9foridentificationofbladdercancercellsCRISPR-Cas9细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR-Cas9通过具有引导作用的sgRNA（shortguideRNA）靶向修饰基因。bladdercancercells功能基因线路(functiongenecircuit)利用基因模块原有的功能，设计全新的遗传线路，使生物系统具有特定的期望功能。△（1）无细胞合成功能基因线路（2）控制群体数量的功能基因线路（3）控制图案形成的功能基因线路（1）无细胞(cell-free)合成功能基因线路核糖核酸内切酶单链DNA调控基因表达不需要细胞因子的介入，即没有蛋白质的参与。或许生命（或蛋白质）的诞生就是利用这种基因线路来实现的。利用该功能基因线路，可以人为地设计合成需要的各种蛋白质。教学大纲掌握：控制群体数量的功能基因线路，控制图案形成的功能基因线路，合成转录后基因网络，合成跨细胞基因网络了解：合成基因（或蛋白质）网络步骤，合成转录基因网络，合成信号转导网络，合成生理信号响应系统，合成生物学与基因表达的进化，合成基因线路与网络的重构、工程化，组合合成与基因网络的定向进化，工程化基因网络的机遇与挑战（2）控制群体数量（populationcontrol）的功能基因线路细胞增长细胞凋亡（apoptosis）信号分子当信号分子浓度达到或超过阈值后，LuxR与AHL结合，并启动启动子PluxI融合基因检测融合蛋白的表达量引起细胞凋亡整个系统中，随着细胞浓度的增加，环境中的信号分子浓度也增加。信号分子的浓度越高，CcdB基因的表达量越多，凋亡细胞的数量就越多。当细胞的增长与凋亡达到一个动态平衡时，群体数量进入一个相对稳定的状态。细胞密度此环境下可能达到的最大细胞密度CcdB蛋白的浓度细胞生长速率常数细胞死亡速率常数信号分子AHL的浓度CcdB生成速率常数CcdB降解速率常数AHL生成速率常数AHL降解速率常数细胞自然生长的logistic模型细胞凋亡的速率

稳定状态下（3）控制图案形成（patternformation）的功能基因线路既存在于单个细胞也存在于多细胞组织的协调细胞行为的标志性行为。包括细胞与细胞间的通讯交流细胞内的信号作用过程利用遗传线路对信号浓度距离变化产生的响应，构建细胞群体图案系统。距离近，过高浓度的AHL过表达CI蛋白和LacIM1蛋白，LacIM1蛋白抑制荧光蛋白的启动子距离适当，适量的AHL引起适量的CI蛋白和LacIM1蛋白的表达。CI对下游启动子的抑制作用使lacI基本不表达，LacIM1基因表达的量不足以抑制下游荧光蛋白的启动子距离远，过少的AHL无法开启足量的CI蛋白和LacIm1蛋白，无法抑制下游基因，使lacI基因表达，产生的LacI蛋白抑制荧光蛋白的表达能够穿过细胞膜，浓度向周围成梯度下降不同荧光细胞在多个区域放置多个信号发生细胞两个信号细胞，浓度不一致两个信号细胞三个信号细胞四个高浓度信号细胞Model-guidedquantitativeanalysisofmicroRNA-mediatedregulationoncompetingendogenousRNAsusingasyntheticgenecircuit只有没被miRNA结合的mRNA才能翻译成蛋白质，且蛋白质的浓度与mRNA的浓度成正比。Therefore,thedifferencebetweentheproteinlevelswithorwithoutthecompetingRNAregulationindicatesthestrengthoftheceRNAeffect.红外荧光蛋白蓝色荧光蛋白红色荧光蛋白黄色荧光蛋白TherangeandstrengthofceRNAregulationarelargelydeterminedbytherelativeabundanceandthebindingstrengthofmiRNAandceRNAs.合成基因（或蛋白质）网络转录转录后修饰翻译翻译后修饰步骤合成转录基因网络合成转录后基因网络合成信号转导网络生理信号响应系统合成跨细胞基因网络※△步骤使基因网络概念化，并产生相应的功能抽提要求的生物功能，并利用简单的逻辑网络建模从物理DNA片段库中为线路设计寻找更为合适的遗传装置构建基因网络反复加强设计，使基因线路发挥功能通过实验验证所设计的模型合成转录基因网络（transcriptionalgenenetwork）aTc信号解除对启动子的抑制三阶转录级联线路通过修饰启动子区域控制基因的转录改变转录因子的亲和力操纵子（operon）luxlac阻尼振荡氮调节子INRI~P达到最大值时激活glnKp自然界控制系统由多个正负反馈回路构成彼此交联嵌套诱导反义RNA的表达形成无法翻译的双链mRNA及mRNA的降解siRNA（SmallinterferingRNA）技术沉默基因表达合成转录后基因网络（post-transcriptionalgenenetwork）※四环素红霉素报告基因，人胎盘分泌碱性磷酸酶入入通过四环素（

tetracycline）的加入，或者通过红霉素撤销产生的转录后水平上的mRNA报告基因沉默，最终实现在转录后水平上对SEAP的调控。在翻译水平上构建基因网络。核糖体组装的翻译起始因子4G的切割突变体雷帕霉素荧光素酶基因在转录水平上通过四环素的加入，关闭eIF4G融合蛋白的表达来实现可控。或者是在翻译水平通过雷帕霉素的加入产生功能eIF4G来进行可控。合成信号转导网络（signaltransductionnetwork）信号转导细胞表面受体配体识别细胞质信使信号加工细胞核转录元件调控基因表达细胞外配体结合到细胞表面受体分子上激活下游转录因子激活的转录因子自身表达水平上调细胞表面受体的表达水平上调生理信号响应系统为了实现对某些疾病治疗的目标，设计能够对外源信号和内源生理信号均产生响应的基因网络是非常必要的。对病理信号响应产生治疗结果通过外源调节进行修正正常含氧条件下缺氧条件下原始霉素报告基因，分泌型淀粉酶组织缺氧诱导因子△细胞间通讯与细胞内信号加工合成跨细胞(trans-cellular)基因网络人类胚肾细胞中国仓鼠卵巢细胞处于同一气体氛围人生物素酶醇脱氢酶定向进化基因线路与网络合成生物学与基因表达的进化合成基因线路与网络的重构、工程化组合合成与基因网络的定向进化工程化基因网络的机遇与挑战合成生物学与基因表达的进化生物学表型的进化通常依赖于基因表达的变化，而不是编码蛋白质序列的变化基因表达是由相互作用的调控因子构成的网络来调控的。合成生物学——进化——优化功能生物学过程与功能是如何起源于纯粹的物理和化学过程的进化理论的一个基本预测在一个既定环境的进化过程中，蛋白质表达水平自身优化达到对环境的最大限度的适应。适应性与蛋白质表达水平的关系很难确定。合成生物学使研究者能够设计简单的遗传线路在该线路中，感兴趣的蛋白质表达水平能够通过精确调节以测定生物体在蛋白质表达水平上的适应性。大肠杆菌中表达lac操纵子（编码lacZ和lacY）好处：在乳糖代谢过程中提供能量和碳源；花费：LacZ和LacY表达的代谢负担。对于环境中一个既定的乳糖浓度，存在一个最优的lac操纵子表达量。在不同乳糖环境中的实验室进化发现，大肠杆菌能够将lac操纵子的表达水平进化到一个既定的浓度。生命体面临生存环境的多重挑战波动的营养来源、大量的压力条件，以及与其他生物潜在的有毒相互作用等。代谢的遗传调节的目标——使生存最大化大肠杆菌在甘油中生长，根据虚拟模型的预测，观察到基因表达进化使生长速率最大化。其他选择压力——其他功能方面优化枯草芽孢杆菌删除突变体比野生型生长迅速。储备了大量的资源，以期对即将变化的环境产生响应。这些发育途径在饥饿条件下激活，而在营养充足的条件下抑制。基因表达是一个资源丰富条件下快速生长和对环境变化预期的折衷。远古蛋白的序列进化树和统计学对一个现代家族蛋白推导所得由化学合成所得，并在细胞中表达或体外研究合成的策略重新构建一些古代基因表达图谱合成基因线路与网络的重构、工程化(engineering)利用遗传元件工程化细胞中复杂行为。利用细菌检测预先设定图像的边缘处于暗环境的细菌产生一个可扩散的化学信号AHLPCB磷酰基只有对图像光区域和扩散信号敏感的细菌，能够产生色素，作为边缘图像的输出。细胞的适应性和表型对重构的转录调控网络的响应。特定的重构菌株比野生菌株具有更强的生长能力。生命体能够通过调控网络的微小变化来实现进化；网络的差异在很大程度上是能够忍受的。合成生物学DNA的物理合成与组装新的基因、基因组及基因网络完整的染色体和基因组生活方式策略营养的获得海洋细菌生长最优化营养丰富营养贫乏工程化的支架蛋白利用工程化的合成支架蛋白作为空间上区域化的信号节点，将基于支架蛋白的反应整合在一起，得到完全依赖于蛋白质相互作用的、可重新配置的人工信号通路。细胞中，构成通路的信号蛋白分子通常由支架物蛋白物理地组装成联合体，通过支架来定向信息流，提高匹配蛋白的信号传递，同时通过辅助蛋白激酶和磷酸酶与它各自的底物结合而起作用，保证信号传递的特异性和高效性。支架联合体作为反馈回路的集散中心承担着调节蛋白质活性和实现蛋白质重新组装的作用，对信号通路动态响应行为进行调节。因此，支架蛋白对于通路响应的动态行为至关重要。这种工程化策略让支架蛋白成为一个灵活的平台，利用支架蛋白在空间上的局域化作用建立精细的微观结构，在诱导信号的调控下重新配置信号通路，实现期望的时序和动力学行为。组合合成与基因网络的定向进化（directedevolution）基因网络连接库通过特定位点变换不同的元件，创造元件间的连接库，而同时维持整体网络骨架的完整性。构建策略通过对库的筛选，产生逻辑线路。研究策略对组合合成网络逐个筛选。对逻辑门的研究发现，一些突变能够将输入由AND转变为OR研究表明，具有同样拓扑学的网络可能具有不同的功能，而具有相似行为的网络可能具有不同的拓扑特征。在适当的条件下，合成基因网络可以通过进化来很好地调整其结构。E.coli转录启动子的重构研究网络能够耐受新的链接对标准元件库的合成与筛选将启动子区域随机化，产生具有不同转录水平的启动子，接着利用计算机模型筛选哪一个启动子突变体可用来设计合成基因网络。通过多样性的产生与筛选获得需要的基因功能，可以用来合理设计与优化基因线路，并且用于基因组规模上的操作。在大肠杆菌单一细胞或群体中的染色体上引入DNA的错配、插入和删除等，使该过程自动化，用于大肠杆菌工程菌种的进化，生产蕃茄红素。工程化基因网络的机遇与挑战

（opportunitiesandchallenges）载体转化系统质量控制分析T7噬菌体大肠杆菌替代细菌限制特定模块的获得代谢负担合成基因网络依据设计发挥功能的能量需求教学大纲掌握：汉密尔顿路径问题了解：发现新药，疾病治疗，乙醇，高级醇，生物传感系统，大肠杆菌香味剂合成基因线路与网络的应用在医药工业领域中的应用在生物能源领域中的应用其他△在医药工业领域中的应用（1）发现新药（2）疾病治疗（1）发现新药青蒿素（artemisinin）以其高效、快速、低毒等特点，被世界卫生组织认定为21世纪最有效的抗疟疾药。青蒿草青蒿素含量普遍低于1‰，导致植物提取青蒿素的成本很高，产量一直供不应求，费用居高不下。利用合成生物学方法分别将相关基因植入大肠杆菌和酵母中，利用微生物合成青蒿素的前体物质amorphadiene和青蒿酸。大肠杆菌焦磷酸异戊酯二甲基丙烯焦磷酸酯法尼基焦磷酸酯为避免大肠杆菌内源DXP途径的干扰，引入ispC基因，其编码产物可将大肠杆菌内源的DXP途径阻断。酵母抗生素乙硫异烟胺（ETH）一类重要的抗结核药物，常用于感染具有多种耐药抗性结核分枝杆菌患者的治疗，结核分支杆菌酶EthA

ETH操纵子OethR

阻遏蛋白EthR筛选能够穿过细胞膜到达细胞内的病原体，使EthR失活且对哺乳动物细胞没有毒性的复合物。哺乳动物转录反激活子EthR与VP16融合成一个新的转录因子与操纵子OethR结合激活下游哺乳动物启动子激活报告基因筛选EthR抑制剂小分子酯类2-丁酸苯乙酯：能激活结核分枝杆菌中EthA的表达，使病原体对抗生素ETH更加敏感。匹诺塞林匹诺塞林具有良好的生物活性，如神经保护、抗菌、抗氧化等，其中神经保护方面活性使其具有极高的成药性，在2009年匹诺塞林被CFDA批准为I类注射新药，主要适应症为急性脑卒中。化学合成：可以快速得到产物，但需要使用大量有毒化学试剂，反应条件较苛刻。植物提取：尽管匹诺塞林在植物中广泛分布，但含量低、植物组织中物质成分复杂和分离纯化困难等一系列问题大大限制植物提取方法的应用。生物合成：原料价廉、反应要求较低、能耗低和环境友好等特点，具有很好的发展前景。苯丙氨酸裂解酶酪氨酸裂解酶肉桂酸4-羟化酶香豆酸辅酶A连接酶查尔酮合酶匹诺塞林查尔酮柚皮素查尔酮查尔酮异构酶柚皮素S构型的匹诺塞林莽草酸途径噬菌体（bacteriophage）感染某些特定细菌破坏或者削弱耐药菌的耐药机制，加强抗生素的抗菌疗效。设计噬菌体作为辅助用抗生素、合成安全性疫苗、去除病原菌种群、发现小分子化学治疗药物、设计新的生物药品、阐明疾病机制等。（2）疾病治疗（Diseasetreatment）在生物能源(bioenergy)领域中的应用（1）乙醇（2）高级醇（1）乙醇（ethanol）通过定向敲除策略，去除大肠杆菌中与乙醇代谢无关的路径由于乙醇的低能量密度和高吸湿性，使其并不能成为理想的燃料。与