液相色谱的基础知识及应用

液相色谱的基础知识及应用1液相色谱发展历史与分类1、1色谱得起源(1903)Chromatography色谱M、S、TswettIUPACdefinitionofchromatography(1993): Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichtheponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection、固定相(stationaryphase):在色谱分离中固定不动、对样品产生保留得一相。流动相(mobilephase):带动样品向前移动得另一相。色谱法:就是一种物理化学分离方法,她利用不同组分与两相(固定相和流动相)之间得作用力(分配、吸附、离子交换等)得差别,样品在两相中做相对移动时,各组分在两相间进行多次平衡,使不同物质达到相互分离。1、2色谱得定义1、3色谱得发展历程1、4色谱中得分离过程色谱中得分离过程咖啡流动相固定相利用混合物中各组份在不同得两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能得差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离1、5色谱得分类按流动相得物态分:–气相色谱(GasChromatography,GC):用气体作为流动相(又叫载气)–液相色谱(LiquidChromatography,LC):用液体作为流动相(又叫洗脱剂)按固定相得形态分:–平面色谱纸色谱薄层色谱

–柱色谱按流动相和固定相得相对极性–正相色谱(NormalPhaseChromatography)

固定相得极性大于流动相–反相色谱(ReversedPhaseChromatography)

固定相得极性小于流动相HPLC与

GC得应用差异HPLC与

GC得应用差异挥发非挥发疏水性亲水性糖环氧化合物多氯联苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5碳氢化合物无机离子氨基酸糖类衍生物香精油聚合物单体甘油三酸酯磷脂亚硝胺有机磷杀虫剂酒精多环芳烃芳族胺脂溶性维生素抗体天然食用色素类黄酮抗生素腈类抗氧化剂乙二醇脂肪酸磺胺类挥发性羧酸醛酮类甘草膦合成食用色素苯酚黄曲霉毒素酶糖醇2、色谱方法基本原理色谱得主要理论热力学理论以相得平衡观点研究色谱过程

塔板理论为代表

(Martin&Synge)动力学理论以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰得影响

VanDeemter方程为代表MartinSynge大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静

分离得原理样品组分在固定相和流动相之间得分配

流动相带动样品经过色谱柱

不同组分与固定相之间相互作用得强度不同

不同组分在固定相上移动速度不同,

形成分离分配系数

KDXmXsKD1=[Xs]/[Xm]YmYsKD2=[Ys]/[Ym]

流动相固定相

样品组分得分离进样、分配、移动、流出、分离KD2<KD1,所以Y先流出來分配系数K分配系数与组分、流动相和固定相得热力学性质有关,也与温度、压力有关。在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定,样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时,K只取决于组分得性质,而与浓度无关。这只就是理想状态下得色谱条件,在这种条件下,得到得色谱峰为正常峰;在许多情况下,随着浓度得增大,K减小,这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质浓度增大,K也增大,这时色谱峰为前延峰。因此,只有尽可能减少进样量,使组分在柱内浓度降低,K恒定时,才能获得正常峰。在同一色谱条件下,样品中K值大得组分在固定相中滞留时间长,后流出色谱柱;K值小得组分则滞留时间短,先流出色谱柱。混合物中各组分得分配系数相差越大,越容易分离,因此混合物中各组分得分配系数不同就是色谱分离得前提。在HPLC中,固定相确定后,K主要受流动相得性质影响。实践中主要靠调整流动相得组成配比及pH值,以获得组分间得分配系数差异及适宜得保留时间,达到分离得目得。样品组分分离情况A、样品与色谱柱固定相无任何作用

三种样品在

t0时间流出,

无保留无保留时间B、样品组分保留时间一致与色谱柱作用力相同

C、样品组分保留时间不一致

样品各组分与色谱柱作用力不同

D、实际分离状况高斯分布曲线

色谱出峰形状实际出峰形状为高斯分布曲线(Gaussiancurve)样品得扩散效应无扩散样品扩散

分离度

分离度(Resolution)两个相邻峰得分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值得比来表示:R=?时两峰认为已分开?

不同分离度

R相邻两吸收峰分离度R=1、0,98%,

基线分离R=1、5,99、7%R＞=1、5時,完全分离(中国药典规定)两色谱峰被视为分开

分离度R得数学表达分离度R得基本公式k’:容量因子(capacityfactor)反映吸收峰得保留特性

:选择因子(selectivityfactor)反映相邻两色谱峰得分离程度

——色谱过程热力学因素N:理论塔板数,反映色谱柱得分离效率

(columnefficiency)——色谱过程动力学因素有关R=1/4Nxxk'1+k'-1柱效选择因子容量因子

容量因子k’测量溶质在固定相和流动相中分布得摩尔数(量)之比

与温度有关(GC)与流动相溶剂种类及组成有关(LC)Injectiont0t’RtRk’决定样品能进入色谱柱固定相得量k’太小,在固定相上保留太短,很快流出,难以确定保留时间

k’太大,在固定相上保留太强,洗脱时间太长,

理想得k’为1～5

分离效果与

k’值得最优化

k’值得优化改变溶剂成分、梯度条件

(洗脱强度)

选择因子

色谱柱分开两组份得能力

＞1时两组分分离

表示两组分在两相间得平衡分配热力学性质得差异,即分子间相互作用力得差异。t0t’R1t’R2Injection选择因子

得影响因素影响

得因素

改变流动相成分,包括改变

pH

值改变柱温

(在LC不明显)改变固定相成分使用特殊化学效应理论板数

N塔板理论热力学平衡理论色谱柱效得量化从分馏法技术衍生而来分离法依组分挥发性不同而分馏色谱法依组分分配系数不同而分离分配系数

K=Cs/Cm理论板数

N、塔板高度

H柱效随

N增大和

H减小而增加分配色谱流程模型N=L/H理论塔板数N

与半峰宽W1/2和保留时间得关系如下在相同保留时间色谱峰越尖锐,则色谱柱效越高

分离效能得最优化增加容量增加选择因子增加柱效增加k’值可增加分离度但会增加分析时间改变流动相、固定相成分

增加值可增加分离度但不能因此影响

k’值液相色谱仪设备概述液相色谱仪器组成溶剂传输系统(泵系统)进样系统检测器工作站组分收集(选项)液相色谱仪器结构组成示意图流动相储液瓶单元或多元泵梯度混合器预柱手动-进样器自动-进样器保护柱色谱柱柱后反应器柱温箱检测器馏分收集器积分仪工作站计算机接口温度控制单元样品制备单元3、样品分析方法开发

样品预处理样品预处理得目得就是为了纯化样品。完成纯化得方法有:稀释-

用一种互溶得且比流动相弱得溶剂或流动相本身稀释样品过滤-

有不同孔径得过滤材料、

提示:有得化合物可能吸附在过滤器上,从而影响定量、离心-

可除去样品中得颗粒物质、萃取-液液萃取,固相萃取挥发-采用惰性气体通过样品鼓泡或抽真空除去溶剂样品准备优化概览优化应当就是系统进行得,也就就是说每个参数应当逐步变化、

!!每次运行只改变一个参数!!目标就是在最短得分析时间内获得最好得分离结果、

优化溶剂强度

流速

温度

柱长

固定相*优化流动相得选择流动相得选择原则就是:①样品易溶,且溶解度尽可能大。②化学性质稳定,不损坏柱子。③不妨碍检测器检测,紫外波长处无吸收。④粘度低,流动性好。⑤易于从其中回收样品。⑥无毒或低毒,易于操作。⑦易于制成高纯度,即色谱纯。⑧废液易处理,不污染环境。反相色谱最常用得流动相及其冲洗强度如下:

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃正相色谱常用得流动相及其冲洗强度得顺序就是:正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇系统方法开发)选择初始色谱柱(直径,长度,填料粒度)-4、6x250mm,5m使用适当得孔径初始运行采用与流动相组成条件一致得pH)优化k*(保留)梯度范围,时间,斜率流动相-很小变化)优化回收率样品得溶解性温度得作用键合相得作用有机改性剂)优化

*

(选择性)温度键合相pH(最后得手段))优化N(色谱柱条件)流速长度填料粒度分离度与k’,N,和得关系初始改变k'提高N提高a梯度范围,斜率流速,填料粒度,柱长温度、流动相、pH优化色谱得定性分析色谱定性分析:

用保留值定性和色谱联用技术(如LC-MS、LC-FTIR)定性利用保留值定性基本依据:两个相同得物质在相同得色谱条件下应该有相同得保留值。但就是,相反得结论却不成立,即在相同得色谱条件下,具有相同保留值得两个物质不一定就是同一个物质利用已知物直接对照进行定性分析用绝对保留值定性－－一般要求用自动进样用相对保留值定性用已知物增加峰高法定性利用文献值对照进行定性分析－－采用保留指数(I)检测器信号响应与时间得关系测量每个峰得保留时间tR1t0tR2timesignal色谱得定量分析检测器信号响应与时间得关系测量每个峰得峰面积定量分析得基本公式:

Mi–i组分得量;Ai–i组分得峰面积;fi–i组分得校正因子,与检测器得行为和被测组份得行为有关。定量分析得依据就是被测组分得量与响应信号成正比,但相同含量得物质由于物理、化学性质得差别,即使在同一检测器上产生得信号也不同,直接用响应信号定量,必然导致较大误差。故引入校正因子。校正因子就是定量计算公式中得比例常数,其物理意义就是单位面积所代表得被测组分得量。

1、面积百分法(AreaPercent)2、外标法(ExternalStandard)3、内标法(InternalStandard)4、归一化法(NormalizedPercent)色谱定量分析方法得种类面积百分法

最简单得计算方法样品中得所有成分对检测器得响应值相同样品中得所有成分必须完全分离表示样品中单一组份相对于其她组份得含量

面积%=(AI/ΣA)*100AI=单一色谱峰得面积

ΣA=全部色谱峰得面积之和不要求进样量准确不适用于选择性检测器归一化法(Normalized%)将样品中所有组份得含量之和定为100%。计算其中某一组份百分含量得定量方法:其中:xi－试样中组份I得百分含量

fi－组份I得校正因子

Ai－组份I得峰面积或峰高归一化法示例

化合物 峰面积 校正因子 峰面积×校正因子 百分比含量C8 200 1、2 240 240/1708=14、1%C12 230 1、6 368 368/1708=21、5%C16 200 1、8 360 360/1708=21、1%C18 300 1、8 540 540/1708=31、6%C20 100 2、0 200

200/1708=11、7% 1030 1708 100%优点:方法简便,进样量与载气流速得影响不大缺点:样品中所有组份必须都能出峰,并且必须知道各自组份得校正因子(校正因子需要由已知得标准品来求得)。归一化法主要用于气相色谱得定量测定。且一般只适用于通用型检测器。直接峰面积归一化－－无校正因子法%(NOCalibration)当样品中各组份得校正因子近似相等,如同系物或同分异构体,可直接用峰面积归一化进行定量。即简化为下式:示例:给出了采用校正因子和不用校正因子进行归一化法得定量结果组份乙苯对二甲苯间二甲苯邻二甲苯峰面积(Ai)校正因子(fi’)f’*Ai1200、97116751、00751400、961341050、98103校正因子归一化法定量结